使用CHO细胞高效发酵生产rhCG的方法技术

本申请提供了一种使用CHO细胞表达重组rhCG的补料培养发酵方法，包括在发酵混合培养基中加入氯化锰，或者在补料培养基中加入氢化可的松和焦磷酸钠。本申请还提供了所述方法用的相应培养基。的相应培养基。的相应培养基。

【技术实现步骤摘要】
使用CHO细胞高效发酵生产rhCG的方法


[0001]本申请属于蛋白领域和细胞培养领域，具体地，本申请提供了使用CHO细胞高效发酵生产rhCG的方法及其相应培养基。

技术介绍

[0002]人绒毛膜促性腺激素(hCG)由胎盘滋养细胞合成的激素，由α亚基、β亚基组成，目前广泛用于治疗女性不孕、性机能障碍、流产、侏儒症、皮肤瘙痒、皮痒、肿瘤等疾病。
[0003]hCG最早以孕妇尿液为原料，通过沉淀、离子交换层析等方法制备，含较多杂质、来源不确定、有传染疾病风险以及批间差异、易发生过敏反应等，在临床使用中存在风险。之后研究者把研发重点放在了利用重组技术制备和生产，并在临床上逐渐取代尿源HCG。
[0004]虽然有昆虫细胞、神经细胞等宿主的尝试，但目前rhCG生产中最常用的细胞仍然为为CHO细胞。但CHO细胞中蛋白质的表达调控机理、蛋白质翻译后修饰调控系统、细胞生长代谢调控机制等环节仍然缺少深入认识，所以在外源基因的整合策略、高表达菌株的筛选、高效培养基配置、培养工艺调控等方面的理论指导水平都还比较低，相关研究都更多地依赖大量的优化筛选和优化实验来获得较优的操作条件。不仅研究和生产效率低、耗时长、成本高，而且受偶然性因素影响较大。虽然国外先进企业已经通过开发谷氨酰胺合成酶(GS)系统、定制无血清个性化培养基、优化高密度微载体培养工艺和补料策略、应用低成本和低剪切力生物反应器等手段，rhCG的高水平表达仍然需要较长的培养时间(＞20天)和较高的生产成本。
[0005]因此，本领域中仍然有进一步改进CHO细胞生产rhCG技术的需求。

技术实现思路

[0006]前期对发酵参数和细胞等因素的优化后，我们尝试了对发酵混合培养基和补料培养基的改进，研究了多种特殊添加剂对CHO表达rhCG的影响，发现在培养基中加入锰离子、氢化可的松和焦磷酸钠可以有效提高rhCG表达水平。
[0007]一方面，本申请提供了一种使用CHO细胞表达重组rhCG的补料培养发酵方法，包括在发酵混合培养基中加入氯化锰，或者在补料培养基中加入氢化可的松和焦磷酸钠。
[0008]进一步地，加入的氯化锰浓度为3mg/ml，加入的氢化可的松和焦磷酸钠浓度为0.05mg/ml和3mg/ml。
[0009]进一步地，发酵时间为12日。
[0010]进一步地，将密度1.5*106cells/ml以上的细胞接种20L到提前一夜已经预培养的50L发酵混合培养基里，接种完的当天，定为第一天，在培养第3、6、9天时分别加入10L补料培养基。
[0011]进一步地，培养参数为：36.5
±
1℃、pH控制在6.8
‑
7.2、溶氧控制在20
‑
70％，转速控制在60
±
5转/分。
[0012]另一方面，本申请提供了一种CHO细胞表达重组rhCG用培养基，包括发酵混合培养
基和补料培养基，其中发酵混合培养基中加入了氯化锰，或者补料培养基中加入了氢化可的松和焦磷酸钠。
[0013]进一步地，加入的氯化锰浓度为3mg/ml，加入的氢化可的松和焦磷酸钠浓度为0.05mg/ml和3mg/ml。
[0014]另一方面，本申请提供了氯化锰、氢化可的松和/或焦磷酸钠在制备CHO细胞表达重组rhCG用培养基中的应用。
[0015]进一步地，培养基中氯化锰浓度为3mg/ml，氢化可的松和焦磷酸钠浓度为0.05mg/ml和3mg/ml。
附图说明
[0016]图1为CHO细胞发酵生产rhCG的基本流程。
[0017]图2为发酵培养第6日时hCG各亚基的相对丰度。
具体实施方式
[0018]实施例1发酵所用的细胞、培养基及其他试剂
[0019]发酵所用CHO细胞为申请人自制，使用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂将携带rhCGα、β亚基的载体转染入CHO细胞K1株中制成，该细胞随后被无血清驯化并已经在申请人rhCG的试验性生产中运用超过18个月。
[0020]申请人为发酵过程配制的培养基：
[0021]传代培养基：
[0022]CD CHO AGT 24.3mg/ml、一水磷酸二氢2.69mg/ml、磷酸氢二钠4.33mg/ml、L
‑
精氨酸550mg/ml、L
‑
天冬酰胺1300mg/ml、L
‑
天冬氨酸400mg/ml；
[0023]发酵混合培养基：
[0024]CD CHO AGT 24.3mg/ml、CD OPTICHO AGT 9.66mg/ml、一水磷酸二氢钠2.69mg/ml、磷酸氢二钠4.33mg/ml、生物素0.15mg/ml、叶酸11.5mg/ml、肌醇120mg/ml、氯化钾300mg/ml、葡萄糖5500mg/ml、氯化钠2100mg/ml、大豆水解蛋白30mg/ml；
[0025]补料培养基：
[0026]BalanCD CHO Feee3 66mg/ml、一水磷酸二氢钠2.69mg/ml、磷酸氢二钠4.33mg/ml、L
‑
精氨酸2000mg/L、L
‑
天门冬氨酸4500mg/L、维生素C15mg/L、维生素H 5mg/L叶酸30mg/L、肌醇400mg/L、维生素B12 5mg/L、氯化钾0.0015mg/L、F
‑
68 950mg/L、葡萄糖18000mg/L；
[0027]HCG ELISA试剂盒：日本东曹；
[0028]MnCl2：济南凯创化工有限公司；
[0029]CD CHO AGT：gibco
[0030]CD OPTICHO AGT：gibco
[0031]BalanCD CHO Feee3：irvine scientific
[0032]焦磷酸钠：食品级，山东冠特生物工程有限公司；
[0033]氢化可的松：上海麦克林生化科技有限公司；
[0034]其他包括PCR试剂和仪器在内的试剂和仪器均为常规国产。
[0035]实施例2基本发酵生产过程
[0036]细胞复苏：
[0037]1)取细胞冻存管，置于37℃水浴锅内直至冻存的细胞悬液融化。
[0038]2)在吸取冻存细胞转至装有6～7ml CHO传代培养基的离心管内，离心1000rpm，5分钟，去除上清。
[0039]3)用分次吸取10mlCHO传代培养基轻轻吹打离心管内底部的成团细胞。
[0040]4)接种至装有10mlCHO传代培养基的125ml摇瓶内，使最终体积约为20ml，接种细胞密度为0.4
‑
1.0*106个细胞/ml。将摇瓶置于二氧化碳培养箱中36.5
±
1℃、5
±
3％CO2、125
±
10rpm进行培养。
[0041]传代：
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种使用CHO细胞表达重组rhCG的补料培养发酵方法，其特征在于，包括在发酵混合培养基中加入氯化锰，或者在补料培养基中加入氢化可的松和焦磷酸钠。2. 根据权利要求1所述的方法，其中加入的氯化锰浓度为3mg/ml，加入的氢化可的松和焦磷酸钠浓度为0.05 mg/ml和3mg/ml。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中发酵时间为12日。4. 根据权利要求3所述的方法，其中将密度1.5*106cells/ml以上的细胞接种20L到提前一夜已经预培养的50L发酵混合培养基里，接种完的当天，定为第一天，在培养第3、6、9天时分别加入10L 补料培养基。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其中培养参数为：36.5
±
1℃、pH...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏星辉，胡锦晶，高乃波，
申请(专利权)人：宁波人健药业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：