多肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种多肽的制备方法。该制备方法包括以下步骤：构建Sumo标签融合表达多肽基因的工程菌株，并诱导工程菌株可溶表达多肽；从工程菌株中纯化得到含有多肽前体的粗蛋白；对含有多肽前体的粗蛋白采用Ulp1蛋白酶进行酶切，切除Sumo标签；采用乙腈结合加热沉淀的方法或采用六氟异丙醇沉淀的方法纯化Ulp1蛋白酶的酶切产物，得到多肽。本发明专利技术建立了高效的基于可溶性重组表达药用多肽或其前体的技术，建立了基于一步沉淀纯化的简单纯化工艺，进一步的结合HPLC精制即可达到97%以上多肽纯度。肽纯度。肽纯度。

【技术实现步骤摘要】
多肽的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体而言，涉及一种多肽的制备方法。

技术介绍

[0002]多肽类药物因其具有类似蛋白和小分子药物双重特性而备受关注，仅2015年多肽药物的销售就占据药物市场的5%，达到500亿美元，并且以每年9
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10%的速度上涨，因此亟待建立高效的低成本的多肽合成和纯化技术。多肽合成主要包括化学法、化学/酶法和生物法。其中，化学方法需要复杂的保护和脱保护过程，需要用到大量的有毒试剂，且可能产生消旋体；化学/生物法通常是用化学方法合成多肽，进一步通过特定的肽连接酶将多个肽段进行连接，工艺相对复杂，连接效率和特异性受到多肽序列的影响；生物法包括采用水解酶水解植物蛋白或动物蛋白然后提取获得特定的有功能的多肽，但是通常产量较低，周期长，污染重，难实现工业化生产；另一种较为普遍的方法是重组表达，即采用基因工程的技术手段在原核或真核生物中引入目标基因表达元件，通过微生物发酵实现目标多肽的高效合成，然而由于多肽自身比较短，很难形成特定的空间结构，导致其非常容易被表达宿主的蛋白酶所降解，此外复杂的纯化工艺又降低了产物收率，增加了成本。
[0003]目前，利用重组法生产的多肽包括多肽类抗生素、干扰素、利拉鲁肽前体（GLP
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1）和胰岛素等，其中的GLP
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1是由诺和诺德开发的用于治疗II型糖尿病的多肽药物，每年的销售额达到数十亿美元，其最初的合成方式是基于酿酒酵母分泌表达的工程菌株，然而由于其胞外蛋白酶的作用导致产物容易被降解，产量较低，敲除蛋白酶后表达的最高水平只有59 mg/L。毕赤酵母中融合表达GLP
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1, 发酵5天的表达量只有26 mg/L。大肠杆菌作为一种常用的宿主，已被广泛用于多肽的生物合成，然而同样存在蛋白酶降解的风险，通过融合表达可以解决此类问题。目前GLP
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1主要采用包涵体融合表达，如KSI标签，内涵肽intein和信号肽
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肠激酶酶切位点
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GLP
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1等，虽然包涵体表达量较高，可以避免蛋白酶降解，但复杂的变性和复性的过程要用到大量变性剂如尿素或盐酸胍，纯化工艺复杂导致最终得率非常低。同时为了将融合标签完全去除通常需要用到肠激酶，该酶不仅难表达且会造成非特异切割。近来采用MFH融合标签构建的包涵体表达，结合甲酸切割和变性条件下纯化的工艺，避免了复性过程，但需用到尿素，进一步通过Tev蛋白酶切割获得N端含有一个Gly的GLP
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1，且Tev酶生物活性较低和产生非特异切割，生产步骤繁琐，成本高。其他的融合标签如GST，MBP，TrxA等多用作可溶表达的标签，且一些肽经过这些标签获得了可溶表达，但是这些标签的分子量相对某些目标肽来说都偏大，导致去除标签后目标肽的得率偏低。此外GLP
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1及其衍生物多呈聚合体状态，纯化需要在变性条件下进行，目前的纯化步骤复杂，得率低下。
[0004]总的来说，现有技术主要存在以下问题：1）化学合成：工艺复杂，化学试剂有毒，可能产生消旋体，周期较长，产品的质量控制比较困难；2）包涵体表达：变复性纯化工艺复杂，用到大量的尿素，切割过程中用到的肠激酶或Tev价格昂贵，易产生非特异性切割；复杂的变复性工艺导致纯化过程非常复杂，得率降低；3）可溶表达：目前用到的可溶表达标签主要包括TrxA，GST，MBP，在目标肽段和标签需要加上酶切位点，常用到的酶通常难表达，且会造
成非特异切割，没有将Sumo标签用于利拉鲁肽前体融合表达的研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在提供一种多肽的制备方法，以解决现有技术中多肽纯化步骤复杂、得率较低的技术问题。
[0006]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种多肽的制备方法。该制备方法包括以下步骤：构建Sumo标签融合表达多肽基因的工程菌株，并诱导工程菌株可溶表达多肽；从工程菌株中纯化得到含有多肽前体的粗蛋白；对含有多肽前体的粗蛋白采用Ulp1蛋白酶进行酶切，切除Sumo标签；采用乙腈结合加热沉淀的方法或采用六氟异丙醇沉淀的方法纯化Ulp1蛋白酶的酶切产物，得到多肽。
[0007]进一步地，多肽为利拉鲁肽前体、奈西利肽或特立帕肽。
[0008]进一步地，Ulp1蛋白酶为通过构建Ulp1蛋白酶表达菌株并诱导表达获得，其中，Ulp1蛋白酶与伴侣蛋白共表达。
[0009]进一步地，伴侣蛋白为GroEL/S伴侣蛋白。
[0010]进一步地，乙腈结合加热沉淀的方法包括：将Ulp1蛋白酶的酶切产物调整pH至5.6，然后加入乙腈，混匀后在60~80℃热处理0.5~3 h（优选在70℃热处理2 h），之后离心分离上清和沉淀。
[0011]进一步地，乙腈为质量百分含量为20~70%的乙腈水溶液。
[0012]进一步地，从工程菌株中纯化得到含有多肽前体的粗蛋白包括：将工程菌株的、超声破碎、离心、过滤膜后获得粗酶液，然后采用亲和层析或阴离子柱进行纯化，得到粗蛋白。
[0013]进一步地，六氟异丙醇沉淀的方法包括：将Ulp1蛋白酶的酶切产物调整pH至5.6，然后加入六氟异丙醇，混匀后在室温沉淀1 h，之后离心分离上清和沉淀。
[0014]进一步地，六氟异丙醇为质量百分含量为20~70%的六氟异丙醇水溶液；优选的，六氟异丙醇为质量百分含量为50%的六氟异丙醇水溶液。
[0015]进一步地，制备方法包括采用HPLC 纯化目标多肽的步骤。
[0016]本专利技术建立了高效的基于可溶性重组表达药用多肽或其前体的技术，建立了基于一步沉淀纯化的简单纯化工艺，进一步的结合HPLC精制即可达到97%以上多肽纯度。
附图说明
[0017]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1示出了实施例1和5中Sumo
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Lira融合蛋白表达、亲和层析纯化的目标蛋白的SDS
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PAGE电泳图，其中，Lane 1：蛋白分子量标准；Lane 2：Sumo
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Lira可溶表达部分；Lane 3：流穿样品；Lane 4：60 mM咪唑洗脱产品；Lane 5：300 mM咪唑洗脱产品；图2示出了实施例2和3中Sumo
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Nesi和Sumo
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Teri融合表达的目标蛋白的SDS
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PAGE电泳图，其中，Lane 1：蛋白分子量标准；Lane 2、3：Sumo
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Teri 可溶表达部分；Lane 4：Sumo
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Teri 沉淀部分；Lane 5：Sumo
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Nesi 可溶表达部分；Lane 6：Sumo
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Nesi 沉淀部分； 图3示出了实施例4中Ulp1的表达优化过程中目标蛋白的SDS
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：构建Sumo标签融合表达多肽基因的工程菌株，并诱导所述工程菌株可溶表达所述多肽；从所述工程菌株中纯化得到含有多肽前体的粗蛋白；对含有所述多肽前体的粗蛋白采用Ulp1蛋白酶进行酶切，切除所述Sumo标签；采用乙腈结合加热沉淀的方法或采用六氟异丙醇沉淀的方法纯化所述Ulp1蛋白酶的酶切产物，得到所述多肽。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述多肽为利拉鲁肽前体、奈西利肽或特立帕肽。3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述Ulp1蛋白酶为通过构建Ulp1蛋白酶表达菌株并诱导表达获得，其中，所述Ulp1蛋白酶与伴侣蛋白共表达。4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述伴侣蛋白为GroEL/S伴侣蛋白。5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述乙腈结合加热沉淀的方法包括：将所述Ulp1蛋白酶的酶切产物调整pH至5.6，然后加入乙腈，混匀后在60~80℃热处理0....

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯，
申请(专利权)人：凯莱英医药集团天津股份有限公司，
类型：发明
国别省市：