酶催化合成嘌呤核苷的方法及组合物技术

本发明专利技术提供了一种酶催化合成嘌呤核苷的方法及组合物。其中，该方法利用嘌呤核苷磷酸化酶以及如下任一种酶：嘧啶核苷磷酸化酶或胸苷磷酸化酶，催化底物合成嘌呤核苷；底物包括底物核苷和底物碱基；嘧啶核苷磷酸化酶包括PyNP，PyNP为SEQ ID NO：1所示的蛋白质；胸苷磷酸化酶包括TP，TP为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；嘌呤核苷磷酸化酶包括PNP，PNP为SEQ ID NO：3所示的蛋白质。能够解决现有技术中的利用酶法合成嘌呤核苷产量低的问题，适用于酶催化领域。域。域。

【技术实现步骤摘要】
酶催化合成嘌呤核苷的方法及组合物


[0001]本专利技术涉及酶催化领域，具体而言，涉及一种酶催化合成嘌呤核苷的方法及组合物。

技术介绍

[0002]嘌呤核苷及其类似物可作为前体或者终产品广泛应用于医药领域，如抗病毒，抗肿瘤等药物。目前，嘌呤核苷及其类似物主要以化学法合成(WO2021186328A1、CN113173961A、CN111592542A、CN111253455A、CN110627729A、CN102127135A，WO2010113937A1，WO2009058800A2、CN101250210A、US2005171126A1、EP1108724A2)，其合成工艺较为繁琐，需要严苛的反应条件，且化学法合成的产品纯化步骤复杂，与其异构体难以分离，会导致收率不高而引起成本较高等问题。此外，化学合成会用到毒性试剂，往往对环境造成较大的破坏。
[0003]此外，嘌呤核苷还可以微生物发酵法生产(CN112553135A、CN112574934A、CN113151238A、CN113278596A、CN112143751A、CN112126666A、CN113373100A、CN102171346、CN101120090A、CN1831115A、CN1270631A)。目前微生物发酵法生产嘌呤类核苷多限于天然核苷如腺苷，鸟苷和肌苷等的生产，且耗时长，产量较低，离工业化生产还有一定的距离。
[0004]近些年，嘌呤核苷的酶法合成由于步骤少，收率较高，光学纯度高，环境友好等优点，可以避免上述的问题而受到较多的关注。嘌呤核苷的酶法合成可经多种路线使用不同酶得以实现，如专利EP1457568A1公开了一种生物酶催化方法，可以利用N
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脱氧核糖转移酶II(nucleoside deoxyribosyl transferase II)和核苷酶(nucleosidase)以胸苷和鸟嘌呤为底物反应32h合成31mM 2'
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脱氧鸟苷。此外，该专利还以上述两种酶并结合腺苷脱氨酶(adenosine deaminase)用两步法反应约30h最终合成超过40mM 2'
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脱氧鸟苷。此外，嘧啶核苷磷酸化酶(pyrimidine nucleoside phosphorylase)和嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase)也可以被用于合成嘌呤核苷。专利CN102770532A公开了一种可以利用嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶将嘧啶核苷和嘌呤碱基进行生物转化的方法，可以将尿苷或2'
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脱氧尿苷和嘌呤碱基转化成2,6
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二氨基嘌呤核苷和2,6
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二氨基嘌呤
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2'
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脱氧核苷，转化率超过90％，但产量低于5mM。专利CN1207417A利用芽孢杆菌属脂肪嗜热杆菌(Bacillus stearothermophilus JTS859)来源的嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶以及节细菌属来源的尿嘧啶和胸腺嘧啶分解酶液，以胸苷和相应的嘌呤碱基为底物，反应110小时可生产14.9mM 2'
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脱氧鸟苷，产率为75％，反应90小时可得到17.7mM的2'
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脱氧腺苷，产率为88.5％。但上述公开的酶法合成，均具有转化率低、产量低或反应时间长等的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的在于提供一种酶催化合成嘌呤核苷的方法及组合物，以解决现有技术中的酶法合成嘌呤核苷产量低的问题。
[0006]为了实现上述目的，根据本专利技术的第一个方面，提供了一种酶催化合成嘌呤核苷的方法，该方法利用嘌呤核苷磷酸化酶以及如下任一种酶：嘧啶核苷磷酸化酶或胸苷磷酸化酶，催化底物合成嘌呤核苷；底物包括底物核苷和底物碱基；嘧啶核苷磷酸化酶包括PyNP，PyNP为SEQ ID NO：1所示的蛋白质；胸苷磷酸化酶包括TP，TP为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；嘌呤核苷磷酸化酶包括PNP，PNP为SEQ ID NO：3所示的蛋白质。
[0007]进一步地，底物核苷为式I所示的核苷，R1选自
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H或
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OH，R2选自
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H或
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CH3；优选地，底物核苷包括胸苷，尿苷或2'
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脱氧尿苷。
[0008][0009]进一步地，底物碱基为式II或式III所示的碱基，X选自
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NH3或
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OCH3，Y选自
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H或
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NH2；优选地，底物碱基包括鸟嘌呤，腺嘌呤、2,6
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二氨基嘌呤或6
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甲氧基鸟嘌呤；
[0010][0011]进一步地，PyNP、TP、或PNP中的一种或多种为纯化蛋白、粗酶液或固定化酶。
[0012]进一步地，上述方法中：底物核苷的浓度为2～400mM，底物碱基的浓度为1～200mM。
[0013]进一步地，酶催化的催化时间为2～18h。
[0014]进一步地，酶催化的催化温度为60～70℃。
[0015]为了实现上述目的，根据本专利技术的第二个方面，提供了一种组合物，该组合物包括嘌呤核苷磷酸化酶以及如下任一种酶：嘧啶核苷磷酸化酶或胸苷磷酸化酶，其中，嘧啶核苷磷酸化酶为PyNP，PyNP为SEQ ID NO：1所示的蛋白质；胸苷磷酸化酶为TP，TP为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；嘌呤核苷磷酸化酶为PNP，PNP为SEQ ID NO：3所示的蛋白质。
[0016]进一步地，组合物包括PyNP、TP或PNP中的一种或多种为纯化蛋白、粗酶液或固定化酶。
[0017]进一步地，组合物还包括底物核苷和底物碱基；底物核苷为式I所示的核苷，R1选自
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H或
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OH，R2选自
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H或
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CH3；底物碱基为式II或式III所示的碱基，X选自
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NH3或
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OCH3，Y选自
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H或
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NH2；优选地，底物核苷的浓度为2～400mM，底物碱基的浓度为1～200mM；
[0018][0019]应用本专利技术的技术方案，利用PyNP和PNP、或TP和PNP，共同进行酶催化，以底物核苷和底物碱基为原料，一步法催化生成多种嘌呤核苷，并能够实现放大生产，从而在较短的反应时间内高效合成，提高嘌呤核苷的产量。
附图说明
[0020]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：
[0021]图1示出了根据本专利技术实施例5的2'
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脱氧腺苷的标准曲线示意图。
[0022]图2示出了根据本专利技术实施例7的2'
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脱氧鸟苷的标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶催化合成嘌呤核苷的方法，其特征在于，所述方法利用嘌呤核苷磷酸化酶以及如下任一种酶：嘧啶核苷磷酸化酶或胸苷磷酸化酶，催化底物合成所述嘌呤核苷；所述底物包括底物核苷和底物碱基；所述嘧啶核苷磷酸化酶包括PyNP，所述PyNP为SEQ ID NO：1所示的蛋白质；所述胸苷磷酸化酶包括TP，所述TP为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；所述嘌呤核苷磷酸化酶包括PNP，所述PNP为SEQ ID NO：3所示的蛋白质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物核苷为式I所示的核苷，R1选自
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H或
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OH，R2选自
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H或
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CH3，优选地，所述底物核苷包括胸苷，尿苷或2'
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脱氧尿苷。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物碱基为式II或式III所示的碱基，X选自
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NH3或
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OCH3，Y选自
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H或
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NH2，优选地，所述底物碱基包括鸟嘌呤、腺嘌呤、2,6
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二氨基嘌呤或6
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甲氧基鸟嘌呤。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PyNP、所述TP或所述PNP中的一种或多种为纯化蛋白、粗酶液或固定化酶。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯，
申请(专利权)人：凯莱英医药集团天津股份有限公司，
类型：发明
国别省市：