转氨酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种转氨酶突变体及其应用。其中，该转氨酶突变体是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到，突变至少包括：G292A；或者转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列，优选具有85％的同源性，更优选具有90％的同源性。本发明专利技术的上述转氨酶突变体扩大了酶的底物谱、提高酶对大位阻底物的催化能力；同时增强其稳定性，可在高浓度溶剂和高温度条件下进行催化反应；另外，转氨酶突变体的立体选择性也得到了极大的提高，可以更加高效生产手性胺，降低了生产成本和后期处理难度，适合推广用于手性胺的工业生产。广用于手性胺的工业生产。

【技术实现步骤摘要】
转氨酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种转氨酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]手性胺是指小分子化合物手性中心含有氨基的一类化合物，是众多医药及农药的关键中间体，在药品生产和工农业生产中越来越受到人们的重视。其中，手性胺是合成神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等的重要中间体，目前，40％～50％的手性药物都是手性胺类化合物，高效、便捷合成手性胺化合物是有机合成化学研究的重要方向。例如，糖尿病类治疗药物
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西他列汀(Merck公司及Codexis公司)及广谱触杀型除草剂
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草铵膦(Bayer公司)都具有手性胺化学模块。
[0003]目前，制备手性胺的方法主要有化学法、生物拆分法和生物不对称合成法。其中，化学法合成手性胺往往需要使用昂贵的金属催化剂及特制的溶剂，生产成本较高，对映选择性较低，并会造成一定的环境污染；而酶法制备手性芳香胺具有催化效率高、立体选择性强、反应条件温和、环境友好等特点，符合绿色合成的大趋势，因而成为当前研究的热点。目前用于制备手性芳香胺的酶主要为脂肪酶和转氨酶。相对于生物催化剂(脂肪酶)进行手性拆分法制备高纯度手性胺的最大理论收率只有50％，生物不对称合成法(转氨酶)理论收率高达100％，因此其在生产工业领域有着强大的应用前景，相关研究受到了广泛的重视。其中ω
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转氨酶(ω
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TAs)具有对映选择性和区域选择性高、底物谱较广以及无需额外添加昂贵的辅酶的优势，成为工业上用于生产手性胺的重要工业酶之一。
[0004]转氨酶又称氨基转移酶，属于转移酶类，能够可逆催化酮基与氨基之间的氨基转移反应。当这类酶催化的转氨反应中，底物或产物含有α氨基酸时，就称该酶为α转氨酶，反之则称之为ω转氨酶。α转氨酶的产物一般只是α氨基酸，而ω转氨酶能够氨基化酮酸、醛和酮，且具有立体选择性高、辅因子可再生的特点，因此，ω转氨酶被更广泛地应用于合成医药和农药中间体。但是目前报道的野生ω
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TAs中能直接用于制药工业的为数不多，主要受限于酶的不稳定性及不利的反应平衡。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在提供一种转氨酶突变体及其应用，以提高转氨酶的活性。
[0006]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种转氨酶突变体。该转氨酶突变体，转氨酶突变体是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到，突变至少包括：G292A；或者转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列，优选具有85％的同源性，更优选具有90％的同源性，进一步优选具有95％的同源性，再优选具有99％的同源性。
[0007]根据本专利技术的另一方面，提供了一种DNA分子。该DNA分子编码上述任一种转氨酶突变体。
[0008]根据本专利技术的再一方面，提供了一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分
子。
[0009]进一步地，重组质粒为pET
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22a(+)、pET
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22b(+)、pET
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3a(+)、pET
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3d(+)、pET
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11a(+)、pET
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12a(+)、pET
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14b(+)、pET
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15b(+)、pET
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16b(+)、pET
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17b(+)、pET
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19b(+)、pET
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20b(+)、pET
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21a(+)、pET
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23a(+)、pET
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23b(+)、pET
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24a(+)、pET
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25b(+)、pET
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26b(+)、pET
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27b(+)、pET
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28a(+)、pET
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29a(+)、pET
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30a(+)、pET
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31b(+)、pET
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32a(+)、pET
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35b(+)、pET
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38b(+)、pET
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39b(+)、pET
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40b(+)、pET
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41a(+)、pET
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41b(+)、pET
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42a(+)、pET
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43a(+)、pET
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43b(+)、pET
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44a(+)、pET
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49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET
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A、pRSET
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B、pRSET
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C、pGEX
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5X
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1、pGEX
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6p
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1、pGEX
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6p
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2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232
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8、pUC
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18或pUC
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19。
[0010]根据本专利技术的又一方面，提供了一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述重组质粒。
[0011]进一步地，宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌BL21
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DE3细胞或大肠杆菌Rosetta
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DE3细胞；真核细胞为酵母。
[0012]根据本专利技术的再一方面，提供了一种生产手性胺的方法。该方法包括转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，转氨酶为上述任一种转氨酶突变体。
[0013]进一步地，酮类化合物为其中，R1为H、未被取代或被卤素任选取代的C1～C10烷基、未被取代或被卤素任选取代C5～C10环烷基、未被取代或被卤素任选取代的C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，R2为H、卤素、未被取代或被卤素、NH3或带Boc、Cbz保护的NH3中至少一个基团所任选取代C1～C10烷基，R3为未被取代或被卤素任选取代的C6
‑
12的芳基、未被取代或被卤素任选取代的C3
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6的杂环基；优选的，酮类化合物为
[0014]进一步地，氨基供体为异丙胺或丙氨酸，优选为异丙胺。
[0015]进一步地，在转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中，pH为7～11，优选为8～10.5，更优选为10.5；优选的，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系的温度为25～60℃，进一步优选为30～55℃，更优选为50本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到，所述突变至少包括：G292A；或者所述转氨酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列，优选具有85％的同源性，更优选具有90％的同源性，进一步优选具有95％的同源性，再优选具有99％的同源性。2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1所述的转氨酶突变体。3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求2所述的DNA分子。4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pET
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22a(+)、pET
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22b(+)、pET
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3a(+)、pET
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3d(+)、pET
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11a(+)、pET
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12a(+)、pET
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14b(+)、pET
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15b(+)、pET
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16b(+)、pET
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17b(+)、pET
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19b(+)、pET
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20b(+)、pET
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21a(+)、pET
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23a(+)、pET
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23b(+)、pET
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24a(+)、pET
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25b(+)、pET
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26b(+)、pET
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27b(+)、pET
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28a(+)、pET
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29a(+)、pET
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30a(+)、pET
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31b(+)、pET
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32a(+)、pET
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35b(+)、pET
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38b(+)、pET
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39b(+)、pET
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40b(+)、pET
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41a(+)、pET
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41b(+)、pET
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42a(+)、pET
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43a(+)、pET
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43b(+)、...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯，
申请(专利权)人：凯莱英医药集团天津股份有限公司，
类型：发明
国别省市：