【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及rna合成领域，具体而言，涉及一种rna连接酶在寡核苷酸制备上的应用。
技术介绍
1、rna药物是近几年来备受关注的一类新型药物。相比于传统的小分子药物和新型的蛋白药，rna药物有很多优点。例如，rna药物的靶向性很强，只结合目标mrna上的特定序列。另外，相对于小分子药的研发过程，rna药物的研发更快。rna药物可以根据个体差异化进行快速的更改。rna药物大体上可以分为四类：rna适配体(rnaaptamer)，反义寡核苷酸药物(antisense oligonucleotide，aso)，rna干扰(rnai)，信使rna(mrna)。其中，rnai又包括微小rna(mirna)和小干扰rna(sirna)。mrna包括mrna药物，基于mrna的细胞治疗法和mrna疫苗。在这些rna药物中，aso和rnai的主要成分是寡核苷酸(oligonucleotides)，长度一般在二三十个碱基，也是目前使用最多的rna药物类型。
2、目前工业上合成寡核苷酸的主要方法是固相合成法。合成大量的寡核苷酸需要多次累积，并且在进行合成寡核苷酸时，随着链长的增加收率降低。同时，随着链长的增加，得到的产物中的杂质也变多，导致纯化过程繁琐，所有这些都会导致成本的大大增加。对于链长为几+到上百nt的rna，主要通过引物合成实现，合成规模局限在nmol-μmol级别，难以放大至生产规模。目前对需求量大的rna产品，只能通过固相合成多次循环累积得到。例如要获得1mol的寡核苷酸大概需要200次固相合成累积得到。并且，受限于固相
3、很多新型的合成寡核苷酸的方法都在研究中。其中，使用rna连接酶连接反应生成寡核苷酸的方法就是其中之一，此方法具有效率高，成本低和环保等优点。但是，现有技术中报道过的rna酶不能高效连接非天然rna链，而非天然rna药物是当前医药研发的一个重要的新领域，开发一种快速、高效、大量生产非天然rna链的方法是急需的。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于提供一种rna连接酶在寡核苷酸制备上的应用，以解决现有技术中难以高效合成非天然rna链的问题。
2、为了实现上述目的，根据本专利技术的第一个方面，提供了一种rna连接酶在寡核苷酸制备上的应用，rna连接酶包括rna连接酶家族rnl1、rnl2、rnl3、rnl5中任意的一种或多种酶，寡核苷酸包括天然rna或非天然rna。
3、进一步地，rna连接酶包括seq id no：1～55所示的任意一种或多种，或与上述seqid no：1～55所示rna连接酶具有80％以上同源性的酶，优选为85％以上同源性、90％以上、95％以上同源性、98％以上同源性、99％以上同源性、99.5％以上同源性、99.9％以上同源性；应用包括：a)将模版链与rna底物混合、退火、特异性结合，形成带有缺刻的双链核酸结构，rna底物的数量为2～10个；b)利用rna连接酶将缺刻以磷酸二酯键连接；其中，磷酸二酯键连接的核糖核苷酸均为非天然核糖核苷酸；优选地，rna底物的数量为2～3个。
4、进一步地，每个rna底物长度为2～100nt，优选为2～10nt，更优选为4～6nt的rna片段；优选地，核糖核苷酸均为非天然核糖核苷酸；优选地，模版链包括单链rna模版或单链dna模版。
5、为了实现上述目的，根据本专利技术的第二个方面，提供了一种单链rna制备方法，该单链rna制备方法包括：a)将单链dna模版与rna底物混合、退火、特异性结合，形成带有缺刻的dna-rna杂交双链，rna底物的数量为2～10个；b)利用rna连接酶将缺刻以磷酸二酯键连接，形成连续dna-rna杂交双链；c)去除连续dna-rna杂交双链中的dna链，获得单链rna；其中，rna连接酶包括包括rna连接酶家族rnl1、rnl2、rnl3、rnl5中任意的一种或多种酶；磷酸二酯键连接的核糖核苷酸均为非天然核糖核苷酸。优选地，非天然核糖核苷酸包括：具有戊糖环2’位修饰、磷酸根α位修饰或碱基修饰中的一种或多种的核糖核苷酸；优选地，戊糖环2’位修饰包括但不限于2’-甲氧基修饰(2’-och3)、2’-氟修饰(2’-f)、2’-三氟甲氧基修饰(2’-of3)、2’-甲氧乙基修饰(2’-och2ch2och3)、2’-烯丙基修饰(2’-ch2ch＝ch2)、2’-氨基修饰(2’-nh2)或2’-叠氮基(2’-n3)修饰；优选地，磷酸根α位修饰包括磷酸根α位硫代修饰(＝s)；优选地，碱基修饰包括在碱基的n1、n5或n6位中任意一处或多处进行的甲基化修饰(-ch3)和/或乙酰化修饰(-coch3)。
6、进一步地，rna连接酶包括seq id no：1～55所示的任意一种或多种，或与上述seqid no：1～55所示rna连接酶具有80％以上同源性的酶，优选为85％以上同源性、90％以上同源性、95％以上同源性、98％以上同源性、99％以上同源性、99.5％以上同源性、99.9％以上同源性；优选地，利用dna酶降解去除所述连续dna-rna杂交双链中的dna链；优选地，dna酶包括dnasei、dnase1l1或dnase1l2；优选地，rna长度为2～100nt，优选为2～10nt，更优选为4～6nt的rna片段；优选地，核糖核苷酸均为非天然核糖核苷酸；优选地，rna底物的数量为2～3个。
7、进一步地，单链rna包括链式单链rna、半环式单链rna或全环式单链rna。
8、为了实现上述目的，根据本专利技术的第三个方面，提供了一种双链rna制备方法，该双链rna制备方法包括：a)将单链rna模版与rna底物混合、退火、特异性结合，形成带有缺刻的双链rna，rna底物的数量为2～10个；b)利用rna连接酶将缺刻以磷酸二酯键连接，形成双链rna；其中，rna连接酶包括包括rna连接酶家族rnll、rnl2、rnl3、rnl5中任意的一种或多种酶；磷酸二酯键连接的核糖核苷酸均为非天然核糖核苷酸。优选地，非天然核糖核苷酸包括：具有戊糖环2’位修饰、磷酸根α位修饰或碱基修饰中的一种或多种的核糖核苷酸；优选地，戊糖环2’位修饰包括但不限于2’-甲氧基修饰(2’-och3)、2’-氟修饰(2’-f)、2’-三氟甲氧基修饰(2’-of3)、2’-甲氧乙基修饰(2’-och2ch2och3)、2’-烯丙基修饰(2’-ch2ch＝ch2)、2’-氨基修饰(2’-nh2)或2’-叠氮基(2’-n3)修饰；优选地，磷酸根α位修饰包括磷酸根α位硫代修饰(＝s)；优选地，碱基修饰包括在碱基的n1、n5或n6位中任意一处或多处进行的甲基化修饰(-ch3)和/或乙酰化修饰(-coch3)。
9、进一步地，rna连接酶包括seq id no：1～55所示的任意一种或多种，或与上述seqid no：1～55所示rna连接酶具有80％以上同源性的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.RNA连接酶在寡核苷酸制备上的应用，其特征在于，
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RNA连接酶包括SEQ ID NO：1～55所示的任意一种或多种酶；
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，每个所述RNA底物为2～100nt，优选为2～10nt，更优选为4～6nt的RNA片段；
4.一种单链RNA制备方法，其特征在于，所述单链RNA制备方法包括：
5.根据权利要求4所述的单链RNA制备方法，其特征在于，所述RNA连接酶包括SEQ IDNO：1～55所示的任意一种或多种酶；
6.根据权利要求4所述的单链RNA制备方法，其特征在于，所述单链RNA包括链式单链RNA、半环式单链RNA或全环式单链RNA。
7.一种双链RNA制备方法，其特征在于，所述双链RNA制备方法包括：
8.根据权利要求7所述的双链RNA制备方法，其特征在于，所述RNA连接酶包括SEQ IDNO：1～55所示的任意一种或多种；
9.根据权利要求7所述的双链RNA制备方法，其特征在于，所述RNA底物为2
10.根据权利要求7所述的双链RNA制备方法，其特征在于，所述RNA底物的核糖核苷酸均为所述非天然核糖核苷酸；
...【技术特征摘要】
1.rna连接酶在寡核苷酸制备上的应用，其特征在于，
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述rna连接酶包括seq id no：1～55所示的任意一种或多种酶；
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，每个所述rna底物为2～100nt，优选为2～10nt，更优选为4～6nt的rna片段；
4.一种单链rna制备方法，其特征在于，所述单链rna制备方法包括：
5.根据权利要求4所述的单链rna制备方法，其特征在于，所述rna连接酶包括seq idno：1～55所示的任意一种或多种酶；
6.根据权利要求4所述的单链rn...
【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯·盖吉，张娜，焦学成，王召帅，刘芳，马翠萍，耿宇菡，杨益明，李娟，崔丽心，朱文轩，贾旭，
申请(专利权)人：凯莱英医药集团天津股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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