氨酰tRNA合酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种氨酰tRNA合酶突变体及其应用。其中，该氨酰tRNA合酶突变体是由SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列发生突变得到，突变至少包括如下突变位点：第159位I突变为含羟基的氨基酸、碱性氨基酸或非极性氨基酸。应用本发明专利技术的技术方案，上述转氨酰tRNA合酶突变体是在SEQ ID NO：19所示的氨酰tRNA合酶的基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，具有较高的活性和特异性，进而此突变体可以用于实现蛋白质中非天然氨基酸的高效、定点引入。定点引入。定点引入。

【技术实现步骤摘要】
氨酰tRNA合酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及酶工程
，具体而言，涉及一种氨酰tRNA合酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]生物体内的蛋白都是由20种天然氨基酸按照基因信息排列而成，并执行了一系列功能。然而仅有的天然氨基酸携有的功能基团数量有限，无法满足生物科学研究和应用中对蛋白质结构和功能的需求。而携带有多样性功能基团的非天然氨基酸在蛋白质修饰中表现突出，这些非天然氨基酸含有酮基、醛基、叠氮、炔基、酰胺基、硝基、磷酸根、磺酸根等，可进行多种修饰反应，使其在基础研究和药物研发、生物工程等领域都有所应用，例如被广泛用于检测蛋白质结构变化、抗体偶联药物ADC、DNA
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多肽偶联、生物传感器、多肽环化、荧光染料标记、分子表面固定等方面。
[0003]合成编码非天然氨基酸技术是通过额外增加蛋白质翻译机器中的组分，包括一组正交的tRNA，氨酰tRNA合成酶(aaRS)和琥珀密码子(TAG)来实现非天然氨基酸的引入。aaRS/tRNA的正交性要求aaRS不能识别宿主内源的tRNAs或者氨基酸，只能氨酰化其配体tRNA，而tRNA和目标非天然氨基酸也同样不能被内源aaRSs氨酰化。基于来源于古菌Methanocaldococcus jannaschii的酪氨酰
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tRNA合酶/tRNA对(MjTyrRS/TyrT)已被改造，并用于60多种非天然氨基酸的定点引入，其中含炔基非天然氨基酸中的炔基可以与其他含有叠氮基团的分子发生点击化学(click chemistry)反应，从而可以用于制备ADC药物和蛋白标记研究。然而其需要基于抗生素和核酸酶barnase的多轮筛选，工作繁琐且并未获得高效的突变体。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在提供一种氨酰tRNA合酶突变体及其应用，以提高非天然氨基酸的引入效率。
[0005]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种氨酰tRNA合酶突变体。该氨酰tRNA合酶突变体是由SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列发生突变得到的，突变至少包括如下突变位点：第159位I突变为含羟基的氨基酸、碱性氨基酸或非极性氨基酸。
[0006]进一步地，突变至少还包括如下突变位点之一：第31位A突变为非极性氨基酸，第32位Y突变为芳香族或含羟基氨基酸，第107位E突变为带负电氨基酸或含羟基氨基酸，第108位F突变为碱性氨基酸，第109位Q突变为碱性氨基酸，第110位L突变为甲硫氨酸，第158位D突变为酸性氨基酸、含羟基氨基酸或组氨酸，第160位H突变为碱性氨基酸、含羟基或芳香族氨基酸，第161位Y突变为芳香族氨基酸或含羟基氨基酸；第162位L突变为含羟基氨基酸或非极性氨基酸；优选的，突变至少包括如下突变位点组合之一：L69I+E107D+F108R+Q109R+D158H+I159T+H160Q+Y161G+L162T；A31G+Y32S+E107S+D158T+I159S+H160N+Y161S+L162T；Y32S+L69I+E107S+L110M+I159S；A31V+Y32T+L65C+F108R+Q109R+L110M+D158H+I159Y+H160S+Y161G+L162M；A31C+Y32T+E107S+D158S+I159Q+H160F+Y161S+L162T；Y32S+
L65I+E107D+F108K+Q109R+L110M+D158S+I159Q+H160F+Y161G+L162M；A31L+Y32F+L65I+F108R+L110M+D158T+I159L+H160S+Y161S+L162T；或A31V+E107S+Q109R+D158E+I159L+Y161W+L162T。
[0007]根据本专利技术的另一方面，提供了一种DNA分子。该DNA分子编码上述任一种氨酰tRNA合酶突变体；优选的，DNA分子为在SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列基础上基因突变形成。
[0008]根据本专利技术的再一方面，提供了一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。
[0009]进一步地，重组质粒为pET
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22a(+)、pET
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22b(+)、pET
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3a(+)、pET
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3d(+)、pET
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11a(+)、pET
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12a(+)、pET
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14b(+)、pET
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15b(+)、pET
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16b(+)、pET
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17b(+)、pET
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19b(+)、pET
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20b(+)、pET
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21a(+)、pET
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23a(+)、pET
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23b(+)、pET
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24a(+)、pET
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25b(+)、pET
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26b(+)、pET
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27b(+)、pET
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28a(+)、pET
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29a(+)、pET
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30a(+)、pET
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31b(+)、pET
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32a(+)、pET
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35b(+)、pET
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38b(+)、pET
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39b(+)、pET
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40b(+)、pET
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41a(+)、pET
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41b(+)、pET
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42a(+)、pET
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43a(+)、pET
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43b(+)、pET
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44a(+)、pET
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49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET
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A、pRSET
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B、pRSET
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C、pGEX
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5X
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1、pGEX
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6p
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1、pGEX
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6p
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2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232
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18、pUC
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18或pUC
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19。
[0010]根据本专利技术的又一方面，提供了一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。
[0011]进一步地，宿主细胞包括原核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌BL21
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DE3细胞或大肠杆菌Rosetta
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DE3细胞。
[0012]根据本专利技术的再一方面，提供了一种丙炔基
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L
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酪氨酸引入方法。该丙炔基
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氨酰tRNA合酶突变体，其特征在于，所述氨酰tRNA合酶突变体是由SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列发生突变得到的，所述突变至少包括如下突变位点：第159位I突变为含羟基的氨基酸、碱性氨基酸或非极性氨基酸。2.根据权利要求1所述的氨酰tRNA合酶突变体，其特征在于，所述突变至少还包括如下突变位点之一：第31位A突变为非极性氨基酸，第32位Y突变为芳香族或含羟基氨基酸，第107位E突变为带负电氨基酸或含羟基氨基酸，第108位F突变为碱性氨基酸，第109位Q突变为碱性氨基酸，第110位L突变为甲硫氨酸，第158位D突变为酸性氨基酸、含羟基氨基酸或组氨酸，第160位H突变为碱性氨基酸、含羟基或芳香族氨基酸，第161位Y突变为芳香族氨基酸或含羟基氨基酸；第162位L突变为含羟基氨基酸或非极性氨基酸；优选的，所述突变至少包括如下突变位点组合之一：L69I+E107D+F108R+Q109R+D158H+I159T+H160Q+Y161G+L162T；A31G+Y32S+E107S+D158T+I159S+H160N+Y161S+L162T；Y32S+L69I+E107S+L110M+I159S；A31V+Y32T+L65C+F108R+Q109R+L110M+D158H+I159Y+H160S+Y161G+L162M；A31C+Y32T+E107S+D158S+I159Q+H160F+Y161S+L162T；Y32S+L65I+E107D+F108K+Q109R+L110M+D158S+I159Q+H160F+Y161G+L162M；A31L+Y32F+L65I+F108R+L110M+D158T+I159L+H160S+Y161S+L162T；或A31V+E107S+Q109R+D158E+I159L+Y161W+L162T。3.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1至2中任一项所述的氨酰tRNA合酶突变体；优选的，所述DNA分子为在SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列基础上基因突变形成。4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求3所述的DNA分子。5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pET
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22a(+)、pET
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22b(+)、pET
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3a(+)、pET
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3d(+)、pET
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11a(+)、pET
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12a(+)、pET
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14b(+)、pET
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15b(+)、pET
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16b(+)、pET
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17b(+)、pET
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19b(+)、pET
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20b(+)、pET
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21a(+)、pET
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23a(+)、pET
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23b(+)、pET
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24a(+)、pET
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25b(+)、pET
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26b(+...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯，
申请(专利权)人：凯莱英医药集团天津股份有限公司，
类型：发明
国别省市：