一种番茄泛素连接酶基因及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种泛素连接酶及其应用，所述泛素连接酶为如下所述的蛋白：由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同泛素连接酶活性的蛋白。本发明专利技术还提供了制备所述泛素连接酶的方法，还提供了编码所述的泛素连接酶蛋白的氨基酸序列的多核苷酸、包含所述多核苷酸的基因工程载体、宿主细胞，还提供了所述泛素连接酶、所述多核苷酸、所述载体的应用。所述载体的应用。所述载体的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种番茄泛素连接酶基因及应用


[0001]本专利技术涉及分子生物
，尤其涉及一种番茄泛素连接酶基因及应用。

技术介绍

[0002]番茄成熟有绿熟、变色、成熟、完熟4个时期。贮存保鲜可在绿熟期采收。运输出售可在变色期(果实的1/3变红)采摘。就地出售或自食应在成熟期即果实1/3以上变红时采摘。采收时应轻摘轻放，摘时最好不带果蒂，以防装运中果实相互被刺伤。作为我国主要的蔬菜之一，番茄是一种典型的呼吸跃变果实。
[0003]乙烯是植物果实成熟过程中必不可少的一种生物激素，而乙烯的产生或感知被阻断会导致果实不能成熟。绿熟期番茄果实表现为系统II乙烯合成，过程包括：大量基因诱导、自催化乙烯合成，促进成熟。目前番茄已经成为肉质果实发育研究的模式作物，乙烯在决定成熟时间方面起着关键作用，因此通过基因改造呼吸跃变果实的成熟十分重要。
[0004]泛素化是蛋白质组中最普遍的翻译后修饰的方式之一，经过三种酶(E1、E2和E3)的催化，将泛素分子共价结合到靶蛋白上。泛素化广泛参与了诸如转录调节、DNA损伤修复、细胞周期、细胞凋亡、囊泡运输等生理过程。基于此，微生物细胞合成单萜的方法因其原料来源广泛、不受空间和环境的限制、成本低、产物单一且生产周期短而成为替代植物提取和化学合成的热点研究方向。
[0005]相关研究结果表明乙烯受体在乙烯响应途径中充当负调控因子。在不存在乙烯的情况下，有活性受体会抑制乙烯响应。在与乙烯结合时，受体失活，乙烯信号通路开放，发生反应。番茄中已知的乙烯受体有6种，分别是LeETR1,2,4
‑
6和NR。根据基因和蛋白质结构，乙烯受体分为两个亚家族。与拟南芥中研究不同，在番茄中单个亚家族II受体LeETR4的缺失导致了乙烯敏感性的增加。Tieman等人在2000年发表的文献结果显示LeETR4 RNAi植株表现出组成型乙烯响应的表型，包括显著提前果实成熟。这种突变型表型可以通过过表达亚家族I受体NR恢复到野生型。NR和LeETR4转录本在果实成熟过程中上调，但其蛋白质印迹分析显示，受体蛋白水平在果实未成熟阶段最高，成熟初期显著下降；同时乙烯处理会引起受体蛋白的快速降解，这种降解可以被MG132抑制，因此，LeETR4可能通过26S蛋白酶体途径降解，但其具体的降解机制尚未可知。
[0006]LeETR4是参与番茄响应乙烯的生理途径中的重要的信息传递因子，调控其在途径中生成和降解的物质能够显著提高或降低番茄对乙烯的敏感性。基于此，针对现有技术中乙烯受体调控机制的空白，本专利技术提供一种番茄泛素连接酶基因和该基因于番茄成熟中的激素调节作用。本专利技术提供的所述基因和所述基因的应用能够为番茄育种和定向培育提供依据和方向。
[0007]此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本专利技术时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本专利技术不具备这些现有技术的特征，相反本专利技术已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在
技术介绍
中增加相关现有技术之权利。

技术实现思路

[0008]现有研究证明调控番茄果实乙烯响应和成熟的主要是家族II乙烯受体SlETR4，乙烯促进SlETR4蛋白降解，且其突变体表现出早熟和乙烯敏感性增加。
[0009]本专利技术提供一种番茄泛素连接酶基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。优选地，所述基因的开放阅读框具有如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。所述基因被命名为SlRED。
[0010]根据一种优选实施方式，与不表达所述番茄泛素连接酶基因的相同品种的野生型植物相比较，表达番茄泛素连接酶基因的番茄果实早熟。
[0011]本专利技术还提供一种调控乙烯受体S1ETR4蛋白降解的番茄泛素连接酶，所述番茄泛素连接酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，或为在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同泛素连接酶活性的蛋白。所述蛋白的生物学功能为调控番茄乙烯受体SlETR4蛋白稳定性。
[0012]本专利技术提供所述的蛋白或所述基因在调控番茄成熟中的应用。根据一种优选实施方式，与番茄的野生型品种相比较，具有乙烯高敏感表型的所述番茄能够在乙烯处理的条件下加速早熟时间。在一些实施方式中，所述的应用通过如下方式来实现：改变所述基因或所述蛋白在植物中的表达，从而影响乙烯在植物中的功能发挥，由此实现对植物生长的调控。
[0013]通过CRSPR稳定转基因技术获得基因的突变体能够降低基因在植物中的表达。在一些实施方式中，阻断或者降低所述基因或所述蛋白在植物中的表达通过基因编辑技术来实现。
[0014]基于此，本专利技术提供一种产生具有乙烯高敏感表型的番茄的方法，包含：
[0015]在包含番茄泛素连接酶基因的编码区选取至少一个靶标片段，将所述靶标片段或其互补序列插入到CRISPR载体，获得CRISPR/Cas9载体；
[0016]使用所述CRISPR/Cas9载体转化农杆菌，获得含所述CRISPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；
[0017]将所述农杆菌基因工程菌转染番茄的子叶，获得不含外源Cas9蛋白且稳定遗传的纯合突变体株系；
[0018]所述番茄泛素连接酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0019]根据一种优选实施方式，所述番茄的乙烯高敏感表型能够表现在其果实组织中。
[0020]根据一种优选实施方式，用于克隆或检测所述靶标片段的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20。
[0021]根据一种优选实施方式，用于克隆或检测所述靶标片段的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22。
[0022]本专利技术提供一种含有所述基因的生物材料。优选地，所述生物材料为表达载体。优选地，所述生物材料为菌株。
[0023]根据一种优选实施方式，所述表达载体能够为pDIRECT
‑
22C载体。优选地，所述表达载体能够为连接SlRED基因的pDIRECT
‑
22C载体。
[0024]根据一种优选实施方式，所述基因于所述番茄中低表达。
[0025]本专利技术提供一种加速番茄早熟的方法，包含以下步骤：获得具有乙烯高敏感表型的番茄；向具有乙烯高敏感表型的番茄施用乙烯。
[0026]本专利技术提供SlRED基因作为负调控因子在调控乙烯诱导果实成熟过程中的应用。通过基因工程增加SlRED基因的表达量，降低植物对乙烯的敏感度。优选地，植物指番茄。
[0027]本专利技术提供SlRED基因编码的蛋白作为负调控因子在调控乙烯诱导番茄果实成熟过程中的应用，其特征在于，通过基因工程增加所述基因编码的蛋白的表达量，降低植物对乙烯的敏感度。优选地，植物指番茄。
[0028]本专利技术提供一种具有乙烯高敏感表型的番茄。基于SlRED基因编码的蛋白于所述番茄中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种番茄泛素连接酶基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。2.一种调控乙烯受体S1ETR4蛋白降解的番茄泛素连接酶，其特征在于，所述番茄泛素结合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，或为在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同泛素连接酶活性的蛋白。3.含有权利要求1所述基因的表达载体。4.含有权利要求1所述基因的菌株。5.一种产生具有乙烯高敏感表型的番茄的方法，其特征在于，包含：在包含番茄泛素连接酶基因的编码区选取至少一个靶标片段，将所述靶标片段或其互补序列插入到CRISPR载体，获得CRISPR/Cas9载体；使用所述CRISPR/Cas9载体转化农杆菌，获得含所述CRISPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；将所述农杆菌基因工程菌转染番茄的子叶，获得不含外源Cas9蛋白且稳定遗传的纯合突...

【专利技术属性】
技术研发人员：马男，赵清翠，周晓锋，高俊平，杨若昀，赵嘉欣，符茜佳，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：