酶、基因工程菌及其催化生产麦角硫因的方法技术

本申请提供一种生产麦角硫因的方法，包括如下步骤：组氨酸甜菜碱经截短的或未截短的L

【技术实现步骤摘要】
酶、基因工程菌及其催化生产麦角硫因的方法


[0001]本申请涉及生物
，尤其涉及酶、基因工程菌及其催化生产麦角硫因的方法，具体涉及一种酶催化生产麦角硫因的方法、截短的L
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组氨酸甜菜碱硫化酶及其应用、编码L
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组氨酸甲基化酶的核苷酸序列及其应用、截短的L
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组氨酸甜菜碱硫化酶、L
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组氨酸甲基化酶和S
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腺苷蛋氨酸合酶在酶催化生产麦角硫因中的应用、以及，酶的组合。

技术介绍

[0002]麦角硫因(Ergothioneine，简称ERT)是一种含硫的组氨酸衍生物。麦角硫因具有抗氧化、清除自由基及参与细胞内能量调节等功能，与已知的抗氧化剂维生素C和谷胱甘肽相比，其化学性能更稳定，抗氧化能力更显著，因此麦角硫因具有广泛的生物医药应用前景。
[0003]目前麦角硫因主要是通过化学合成法、提取法和生物发酵法获取。化学法合成具有功效的左旋麦角硫因十分困难，工艺繁琐且收率低，而提取法主要是通过对食用真菌进行化学萃取的方法来获取，成本高，产率低且会存留化学试剂。传统的微生物发酵法主要利用蕈菌等食用真菌发酵合成麦角硫因，但由于发酵周期长，产量仅为毫克级别，且分离纯化困难，因此不适用于大规模工业化生产。
[0004]近年来随着麦角硫因在好氧生物和厌氧生物中合成路径的解析，利用基因工程开发高产麦角硫因的基因工程菌株逐渐兴起。在原核生物中，以组氨酸和半胱氨酸为前体，麦角硫因由egtABCDE基因簇编码的egtD，egtB，egtA，egtC和egtE 5个酶催化合成；在真核生物中，组氨酸经egt1催化两步反应生成组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜，随后经egt2催化生成麦角硫因；在厌氧生物中，前体物质组氨酸仅需eanA，eanB两个酶经两步反应就可生成麦角硫因。目前麦角硫因基因工程菌主要是以大肠杆菌、酵母或真菌为底盘细胞，通过引入麦角硫因异源合成酶构建细胞工厂。专利文献CN107250347B公开了利用基因工程改造的曲霉菌，发酵产量可达438mg/L。专利文献CN111534535B公开了利用基因工程改造的圆红酵母，通过引入Neurospora crassa来源的egt1，工程菌摇瓶发酵产量最高可达82.1mg/L。专利文献CN106661585B公开了利用基因工程改造的大肠杆菌，通过引入分枝杆菌的麦角硫因合成基因簇egtABCDE，工程菌发酵产量可达12mg/L。专利文献CN112251392B公开了利用基因工程改造的大肠杆菌，通过改造组氨酸合成路径提高前体组氨酸含量，并引入Mycobacterium smegmatis来源的麦角硫因合成基因，工程菌摇瓶发酵26h产量可达84.7mg/L。专利文献CN104854245B公开了一种新的麦角硫因合成途径，以L
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组氨酸或组氨酸甜菜碱为底物通过egt1和egtE两个酶催化合成麦角硫因。目前公布的麦角硫因基因工程菌产量仍达不到工业化生产的要求，而且利用异源宿主合成麦角硫因增加了宿主细胞的代谢负担，细胞容易代谢失衡，在工业放大时容易出现生长抑制或死亡的情况。
[0005]体外酶催化法制备麦角硫因也有报道，该方法具有效率高、产物纯度高的优点。专利文献CN112301013A公开了一种用于麦角硫因制备的复合酶，利用三个酶经过两步的体外催化实现组氨酸到麦角硫因的合成，由于中间产物组氨酸甜菜碱及硫转移酶稳定性差，第
一步反应结束后需经过滤除酶并充氮气后才可进行下一步的反应，而且仍未解决一些关键技术性问题，限制了麦角硫因的生物制造达到高产的目的。这些问题主要有两方面：(1)所用egtD酶活力低，导致中间产物组氨酸甜菜碱供应不足；(2)反应中最为重要的硫转移酶可溶表达量低，需制备大量的酶用于反应，增加了工业化成本。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的不足，本申请提供一种酶催化生产麦角硫因的方法、截短的L
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组氨酸甜菜碱硫化酶及其应用、编码L
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组氨酸甲基化酶的核苷酸序列及其应用、截短的L
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组氨酸甜菜碱硫化酶、L
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组氨酸甲基化酶和S
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腺苷蛋氨酸合酶在酶催化生产麦角硫因中的应用、以及，酶的组合。
[0007]具体来说，本申请涉及如下方面：
[0008]1.一种截短的L
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组氨酸甜菜碱硫化酶，其为SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列的N端截短序列，优选为从SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列的N端截短1
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50个氨基酸，其序列进一步优选如SEQ ID NO.4所示。
[0009]2、生物材料，所述生物材料为下述任一种：
[0010]A1)编码权利要求1所述L
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组氨酸甜菜碱硫化酶的核酸分子，优选的，所述L
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组氨酸甜菜碱硫化酶的核酸分子如SEQ ID NO.18所示；
[0011]A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
[0012]A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体、或含有A2)所述表达盒的重组载体；
[0013]A4)含有A1)所述核酸分子的重组微生物、或含有A2)所述表达盒的重组微生物、或含有A3)所述重组载体的重组微生物。
[0014]优选地，所述重组微生物为大肠杆菌。
[0015]3.项1所述的L
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组氨酸甜菜碱硫化酶或项2述的生物材料在生产麦角硫因中的应用。
[0016]4.一种生产麦角硫因的方法，包括如下步骤：
[0017]组氨酸甜菜碱经截短的或未截短的L
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组氨酸甜菜碱硫化酶催化获得麦角硫因，其中所述截短的L
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组氨酸甜菜碱硫化酶为权利要求1所述的截短的L
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组氨酸甜菜碱硫化酶。
[0018]5.根据项4所述的方法，其还包括：
[0019]L
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组氨酸和S
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腺苷蛋氨酸经L
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组氨酸甲基化酶催化，获得所述组氨酸甜菜碱。
[0020]6.根据项5所述的方法，
[0021]所述L
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组氨酸甲基化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5所示。
[0022]7.根据项6所述的方法，
[0023]编码所述L
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组氨酸甲基化酶的核酸分子如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示。
[0024]8.根据项7所述的方法，其还包括：
[0025]蛋氨酸和三磷酸腺苷经S
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腺苷蛋氨酸合酶催化，获得所述S
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腺苷蛋氨酸。
[0026]9.根据项8所述的方法，
[0027]所述S
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腺苷蛋氨酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0028]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种截短的L
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组氨酸甜菜碱硫化酶，其为SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列的N端截短序列，优选为从SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列的N端截短1
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50个氨基酸，其序列进一步优选如SEQ ID NO.4所示。2.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：A1)编码权利要求1所述L
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组氨酸甜菜碱硫化酶的核酸分子，优选的，所述L
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组氨酸甜菜碱硫化酶的核酸分子如SEQ ID NO.18所示；A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体、或含有A2)所述表达盒的重组载体；A4)含有A1)所述核酸分子的重组微生物、或含有A2)所述表达盒的重组微生物、或含有A3)所述重组载体的重组微生物。优选地，所述重组微生物为大肠杆菌。3.权利要求1所述的L
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组氨酸甜菜碱硫化酶或权利要求2述的生物材料在生产麦角硫因中的应用。4.一种生产麦角硫因的方法，其特征在于，包括如下步骤：组氨酸甜菜碱经截短的或未截短的L
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组氨酸甜菜碱硫化酶催化获得麦角硫因，其中所述截短的L
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组氨酸甜...

【专利技术属性】
技术研发人员：王浩，杨贵红，左晴晴，冯浩，张一鸣，陆震，郭学平，
申请(专利权)人：北京华熙荣熙生物技术研究有限公司华熙生物科技天津有限公司，
类型：发明
国别省市：