一种修饰核苷的酶催化合成方法技术

本发明专利技术公开了一种修饰核苷的酶催化合成方法，具体涉及利用胸腺嘧啶核苷磷酸化酶与嘌呤核苷磷酸化酶作为生物催化剂，催化2

【技术实现步骤摘要】
一种修饰核苷的酶催化合成方法


[0001]本专利技术属于酶催化领域，具体涉及一种修饰核苷的酶催化合成方法。

技术介绍

[0002]嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase，PNP)，可催化可逆的嘌呤核苷的磷酸解反应。其主要分成两类：低分子量的同源三聚体类(80
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100kDa)；高分子量的同源六聚体类(110
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160kDa)。后一类酶因底物特异性较广，在合成应用中尤为重要，特别是在医药领域有着良好的应用价值和前景。作为单体的核苷类似物已经被广泛应用于癌症和抗病毒治疗。作为抗病毒物质，核苷是通过抑制病毒基因组的复制发挥作用，而作为抗癌化合物则是通过抑制细胞DNA的复制与修复，例如抑制聚合酶活性或者在RNA或DNA合成中充当链终止子。特别是C2
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氟化核苷作为反义寡核苷酸和小干扰RNA的组分效果更好。现有技术中2
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氟
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脱氧腺苷是通过各种化学方法制备的，但是修饰核苷的化学合成受限于立体和区域选择性，以及保护和去保护敏感官能团。相比之下，胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(Thymidine phosphorylase，TP)与嘌呤核苷磷酸化酶可用作生物催化剂，在环境友好条件下有效合成核苷类似物更具有优势，但野生型嘌呤核苷磷酸化酶的活性较低，不够满足生产需求。
[0003]公开号为CN101629169A的专利技术专利申请公开了一种分子改造的嘌呤核苷磷酸化酶及其制备方法。采用PCR技术从嗜热乳链球菌(Streptococcus thermopHilus)中扩增嘌呤核苷磷酸化酶全长片段，用pET
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43.1b(+)质粒构建pET
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43.1b(+)
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PNP重组载体，用定点突变的方法将片段第230位半胱氨酸突变为丙氨酸，用Escherichia coli BL21(DE3)转化为工程菌，获得的突变酶可提高热稳定性。
[0004]公开号为CN103468656A的专利技术专利申请公开了一种突变的假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)的嘌呤核苷磷酸化酶，与野生型的氨基酸序列相比，所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突变为Tyr，突变酶的最高比活性达到45U/mg。就工业化应用而言，嘌呤核苷磷酸化酶的催化性能仍不能达到需求。
[0005]核苷类似物已经被广泛地用于癌症和抗病毒的治疗，但是其昂贵的药物成本阻碍了广泛的生物学研究以及治疗应用。传统的化学合成方法步骤多，耗时长，还需要进行技术难度高的糖基活化以及对糖苷形成的立体和区域选择性控制。因此，能在环境友好的条件下有效合成核苷类似物的生物催化提供了更有吸引力的替代途径，从而使工艺更有效清洁。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对上述技术存在的不足，提供一种修饰核苷的酶催化合成方法。
[0007]一种2
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脱氧腺苷的合成方法，包括以下步骤：
[0008]1)含有目标酶序列的菌株的构建：将目标酶的核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体进行连接，然后将含有目的基因的载体转载至大肠杆菌中进行发酵培养，通过对菌株
的基因序列进行提取和扩增后进行电泳观察结果筛选阳性克隆，获得含有目标酶序列的大肠杆菌菌株；
[0009]2)目标酶的表达和提取：将含有目标酶序列的大肠杆菌挑取到培养基中进行培养，然后加入诱导剂进行发酵培养诱导表达，培养结束后将菌液离心收集菌体，将菌体破碎得含酶裂解液，离心后提取上清液，得到目标酶的粗酶溶液；
[0010]3)游离酶催化反应：配制腺嘌呤母液和2
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氟
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脱氧尿苷母液；向反应体系中依次加入腺嘌呤母液，2
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氟
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脱氧尿苷母液，再加入粗酶溶液进行反应制得2
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氟
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脱氧腺苷。
[0011]其中步骤1)中的目标酶选自胸腺嘧啶核苷磷酸化酶或嘌呤核苷磷酸化酶。
[0012]其中步骤2)中的诱导剂选自IPTG。
[0013]其中步骤3)中的反应体系中腺嘌呤与2
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氟
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脱氧尿苷的摩尔比为1:1.5。
[0014]其中步骤3)中的反应条件为置于将反应体系置于恒温摇床，转速220rpm/min，反应温度为30℃，反应时间为36h。
[0015]另一方面，本专利技术提供一种固定化酶的制备方法，所述的酶选自胸腺嘧啶核苷磷酸化酶或嘌呤核苷磷酸化酶，包括以下步骤：
[0016]i)将氨基树脂用PBS缓冲液清洗后过滤，用PBS溶液配制戊二醛溶液，将氨基树脂与戊二醛混合，随后进行搅拌或振摇，然后过滤并用PBS缓冲液清后过滤获得处理后的氨基树脂；
[0017]ii)分别取含PNP的粗酶溶液或TP粗酶溶液，与步骤i)氨基树脂混合，混合后进行振摇；然后过滤收集氨基树脂，用PBS缓冲溶液清洗后过滤即获得含TP的固定化酶或含PNP的固定化酶。
[0018]其中步骤i)中戊二醛溶液的浓度为2％，氨基树脂与2％戊二醛的混合的质量体积比为1：4。
[0019]其中步骤ii)中PNP的粗酶或TP粗酶与氨基树脂混合比例为1:20。
[0020]本专利技术提供一种固定化酶用于制备2
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氟
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脱氧腺苷。
[0021]另一方面，本专利技术提供了利用固定化酶催化制备2
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氟
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脱氧腺苷的方法，包括以下步骤：
[0022]S1固定化酶的填装：将PNP固定化酶和TP固定化酶分别填装至柱式反应器中，即获得含固定化TP的柱式A反应器和含固定化PNP的柱式B反应器；
[0023]S2反应液的配制：取配制的腺嘌呤母液和2
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氟
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脱氧尿苷母液，加入PBS缓冲溶液稀释备用；
[0024]S3反应：将上述S2反应液流经A反应器，流经时长控制在3h,随后将反应液加入B反应器，置于恒温水浴振荡器，温度设定30℃，反应时长36h；
[0025]S4检测：反应完成后，将样品用注射器和滤膜抽滤制样，进行HPLC检测。
[0026]本专利技术的有益效果：利用胸腺嘧啶核苷磷酸化酶与嘌呤核苷磷酸化酶作为生物催化剂，催化2
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脱氧尿苷(2
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dU)与腺嘌呤进行转糖基化反应生成2
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脱氧腺苷，具有如下效果：
[0027]1.利用生物酶催化合成修饰核苷的方法，相比化学方法大大降低了2
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dA的生产成本，消除了副产物处理过程中产生的环境影响。
[0028]2.采本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种2
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氟
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脱氧腺苷的合成方法，包括以下步骤：1)含有目标酶序列的菌株的构建：将目标酶的核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体进行连接，然后将含有目的基因的载体转载至大肠杆菌中进行发酵培养，通过对菌株的基因序列进行提取和扩增后进行电泳观察结果筛选阳性克隆，获得含有目标酶序列的大肠杆菌菌株；2)目标酶的表达和提取：将含有目标酶序列的大肠杆菌挑取到培养基中进行培养，然后加入诱导剂进行发酵培养诱导表达，培养结束后将菌液离心收集菌体，将菌体破碎得含酶裂解液，离心后提取上清液，得到目标酶的粗酶溶液；3)游离酶催化反应：配制腺嘌呤母液和2
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脱氧尿苷母液；向反应体系中依次加入腺嘌呤母液，2
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脱氧尿苷母液，再加入粗酶溶液进行反应制得2
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脱氧腺苷。2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤1)中的目标酶选自胸腺嘧啶核苷磷酸化酶或嘌呤核苷磷酸化酶。3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤2)中的诱导剂选自IPTG。4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤3)中的反应体系中腺嘌呤与2
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氟
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脱氧尿苷的摩尔比为1:1.5。5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤3)中的反应条件为置于将反应体系置于恒温摇床，转速220rpm/min，反应温度为30℃，反应时间为36h。6.一种固定化酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张坤晓，李梦磊，侯学雯，叶蕾，葛绍勇，
申请(专利权)人：连云港博凯莱特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：