利用烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌高效合成β-烟酰胺单核苷酸的方法技术

本发明专利技术涉及生物酶工程技术领域，特别涉及利用烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌高效合成β

【技术实现步骤摘要】
利用烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌高效合成
β
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烟酰胺单核苷酸的方法


[0001]本专利技术涉及生物酶工程
，特别涉及利用烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌高效合成β
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烟酰胺单核苷酸的方法。

技术介绍

[0002]NMN(全称β
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烟酰胺单核苷酸)——“C11H15N2O8P”,是一种自然存在于所有生命形式的分子。在分子水平上,它是核糖核酸,是核酸RNA的基本结构单位。在结构上,该分子由烟酰胺基、核糖和磷酸基组成。NMN是必需分子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的直接前体,被认为是提高细胞内NAD+水平的关键成分。
[0003]首先，NMN是人体内固有的物质,也富含在一些水果和蔬菜中。NMN存在每一个细胞中参与上千项反应。因烟酰胺属于维生素B3,因此NMN属于维生素B族衍生物范畴,其广泛参与人体多项生化反应,与免疫、代谢息息相关。
[0004]其次，近年来，NMN成分经过了充足的生物实验以及广范的学术论证，是目前国际范围最有效的抗衰老口服成分，在全球知名期刊如《科学》、《细胞》、《自然》等均刊登积极面文章。
[0005]化学方法合成NMN是以烟酰胺、三苯甲酰基
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β
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D
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核糖、四乙酰核糖等为原料，通过糖基化、磷酸化、氨解等关键步骤合成。根据起始原料和保护基团的不同，主要合成路线有多条。如专利CN202210955224.2、CN202011625878.6、CN202110200759.4等。但是化学法存在个别原料价格昂贵、获得困难，路程长且分离困难、成本高、异构体难分离、环保成本大等困难。由于需要用到多种有机溶剂作为媒介，故而利用化学合成工艺获得较纯的化合物在中国申请新食品原料，原则上一般不予批准，综合以上NMN的化学合成路线，采用生物合成为最佳选择。
[0006]生物方法合成NMN主要包括发酵法和酶法，发酵法是借助微生物以类似于酿酒的方式进行生产。如CN201610268173.0，但是该法也有生产效率低下、原料成本高昂等诸多局限性，对于工业化生产来说较为不利。生物酶催化法是目前比较通行的生产方式，主要有以下两条技术路线：一是以D
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核糖和烟酰胺为起始原料，在核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶等的作用下，经过三步催化反应得到NMN，如专利CN202211330622.1，但是该条路线底物转化率不高(以烟酰胺计算，最高不超过50％),且中间产物较多，后续分离纯化较困难，因而总体收率偏低，导致生产成本高。第二条路线是以烟酰胺核糖(NR)为起始原料，在烟酰胺核糖激酶(NR kinase，NrK)和ATP的作用下，一步反应得到NMN，收率高，产品纯度高，未来将成为NMN的主流生产方法。但是烟酰胺核糖激酶的酶活力普遍不高，酶法合成β
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烟酰胺单核苷酸门槛较高，几个关键催化酶价格不菲，约占整个生产过程成本的一大半，但也是较为安全与高效的生产方式。我们在筛选出合适的酶后，对其进行联合的随机和定点饱和突变，使其具有更高的反应活性，成本和质量都自主可控。在采取生物酶催化法生产NMN时，采用食品级原料是保障产品安全性的重要—环。这些用来
生产NMN的加工原料均应出自《中国药典》等相关规定典籍上所载原料，确保有标准可循。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种利用烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌高效合成β
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烟酰胺单核苷酸(NMN)的方法，采用生物工艺合成获得较纯的β
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烟酰胺单核苷酸化合物，使其能够在中国申请新食品原料方面获得批准；以尼克酰胺为底物，在烟酰胺核糖激酶的作用下合成β
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烟酰胺单核苷酸；在筛选出合适的酶后，对其进行联合的随机和定点饱和突变，使其具有更高的反应活性，成本和质量都自主可控；在采取生物酶催化法生产NMN时，采用食品级原料是保障产品安全性的重要—环；这些用来生产NMN的加工原料均应出自《中国药典》等相关规定典籍上所载原料，确保有标准可循。
[0008]本专利技术设计了合理的酶催化反应合成路线用以工业化生产β
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烟酰胺单核苷酸，目的产物β
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单核苷酸(NMN)，结构式如下：
[0009][0010]为实现专利技术目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0011][0012]底物尼克酰胺在烟酰胺核糖激酶(NR Kinase)的作用下生成β
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单核苷酸(NMN),该过程中引入ATP循环再生体系，购买了来自NEB的商业化的ATP再生激酶PPK2。
[0013]本专利技术所使用的实验材料如下：
[0014]在上述反应中，烟酰胺核糖激酶(NR kinase)包含NrK01、NrK02、NrK03、NrK04、Q165K、S97A。其中，NrK01、NrK02、NrK03、NrK04的核苷酸序列由人工合成，Q165K、S97A由NrK02进行联合的随机和定点饱和突变而来，具体为将第165位的Q突变为K，将第97位的S突变为A。
[0015]在本专利技术反应过程中，ATP在和PPK2存在下，可以实现其循环利用，大大降低其使用量。
[0016]作为优选，辅酶因子的镁离子可由氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁、硝酸镁中的一种或多种提供。
[0017]该反应所用的缓冲液Buffer为50mM PBS,pH为6.0～7.5。
[0018][0019][0020]本专利技术的一种利用烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌高效合成β
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烟酰胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：
[0021]步骤1：选用烟酰胺核糖激酶SEQ ID NO.1
‑
6中的一种的核苷酸序列构建与克隆载体；
[0022]步骤2：验证；
[0023]步骤3：酶的表达和提取；
[0024]步骤4：纯化；
[0025]步骤5：反应。
[0026]作为优选，所述步骤1具体为：
[0027]将选用的烟酰胺核糖激酶SEQ ID NO.1
‑
6中的一种的核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pET28a连接得到烟酰胺核糖激酶SEQ ID NO.X
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pET28a，对前述的连接载体采取如下操作：取10μl连接产物加入冰浴的100μl大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗LB培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，随后涂在卡那抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含卡那抗性的LB平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号。
[0028]作为优选，所述步骤2具体为：
[0029]将牙签置于已加入T7通用引物的20μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌高效合成β
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烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：选用烟酰胺核糖激酶SEQ ID NO.1
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6中的一种的核苷酸序列构建与克隆载体；步骤2：验证；步骤3：酶的表达和提取；步骤4：纯化；步骤5：反应。2.根据权利要求1所述的利用烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌高效合成β
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烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述步骤1具体为：将选用的烟酰胺核糖激酶SEQ ID NO.1
‑
6中的一种的核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pET28a连接得到烟酰胺核糖激酶SEQ ID NO.X
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pET28a，对前述的连接载体采取如下操作：取10μl连接产物加入冰浴的100μl大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗LB培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，随后涂在卡那抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含卡那抗性的LB平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号。3.根据权利要求1所述的利用烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌高效合成β
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烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述步骤2具体为：将牙签置于已加入T7通用引物的20μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃，保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含有目标酶序列的大肠杆菌菌株：烟酰胺核糖激酶SEQ ID NO.1
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大肠杆菌。4.根据权利要求1所述的利用烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌高效合成β
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烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述步骤3具体为：将含有目标酶序列的大肠杆菌挑取到含卡那抗性的LB培养基中，于37℃下培养OD至1.0左右后加入终浓度0.7mM的IPTG，置于28℃诱导表达16h，然后将菌液以7000g/min离心6min收集菌体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兆俊，叶蕾，张坤晓，吉利，王海，
申请(专利权)人：连云港博凯莱特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：