一种大豆甲基转移酶基因GmCCOMT及其应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程领域，涉及大豆甲基转移酶基因GmCCOMT及其应用。一种大豆甲基转移酶基因GmCCOMT，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。本发明专利技术还提供了该基因在培育大豆抗SMV品种中的应用。本发明专利技术实验表明沉默该基因并不改变大豆的表型，沉默GmCCOMT的表达能促进SMV的积累，因此可以通过上调该基因从而实现抗SMV的目的。本发明专利技术为改善大豆对大豆花叶病毒抗性的分子育种提供重要基因资源。花叶病毒抗性的分子育种提供重要基因资源。花叶病毒抗性的分子育种提供重要基因资源。

【技术实现步骤摘要】
一种大豆甲基转移酶基因GmCCOMT及其应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程领域，涉及大豆甲基转移酶基因GmCCOMT及其应用。

技术介绍

[0002]CCOMT基因首先在欧芹中被克隆到(Schmit等人，1991)，是苯丙烷途径中调控木质素合成的关键酶之一(Liu等人，2022；Li等人，2021)，木质素沉积在植物
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病原体相互作用期间快速诱导，作为ETI反应，在空间上将病原体限制在感染部位，从而赋予植物抗病能力(Lee等人，2019；Kim等人，2020)。大豆花叶病是由SMV(大豆花叶病毒)引起的世界性大豆病毒病害，在我国各大豆产区也普遍发生，对大豆的实际产量与质量有着重要的影响。为了防止病原体感染，植物进化出了多种复杂的防御机制，包括细胞壁木质化，植物主要防御机制之一是由抗性(R)基因介导的。CCOMT蛋白被证明富含亮氨酸重复结构域(NLR蛋白)，在介导的超敏反应(HR)和植物抗病性中起关键作用(Wang和Balint
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Kurti，2016；Yang等人，2017)。SMV侵染后上调GmCCOMT基因表达，暗示大豆可能遵循类似的途径抵抗SMV侵染。大豆含有丰富的优质蛋白、不饱和脂肪酸、钙及B族维生素是我国居民膳食中优质蛋白质的重要来源，然而在大豆生长发育的过程中，会受到诸多因素的影响而感染SMV，进而对大豆的生长发育产生严重的影响。因此进行大豆抗SMV的研究有助于阐明大豆对SMV的调控网络，有效提升大豆的实际产量与质量，进而为大豆产业的可持续发展奠定良好的基础。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是通过研究SMV侵染大豆的分子机制，进而寻找与SMV发病机制相关的基因，通过对该基因的表达进行调控，来达到抑制SMV的目的，为培育抗病新品种提供基础。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术手段是提供一种大豆甲基转移酶基因GmCCOMT，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
[0005]本专利技术还提供了所述大豆甲基转移酶基因GmCCOMT的应用，该基因可用于培育大豆抗SMV品种。
[0006]本专利技术还进一步提供了一种抗SMV植物品种的培育方法，该方法通过上调所述的大豆甲基转移酶基因GmCCOMT的表达，实现抗SMV的功能。
[0007]本专利技术的有益效果是：本专利技术从大豆中克隆了1个在大豆花叶病毒(SMV)侵染大豆中发挥重要调控作用的基因GmCCOMT，该基因mRNA表达分析表明其在茎和花中表达最多，且受SMV诱导极显著上调，可能参与大豆调控大豆花叶病毒繁殖的过程。实验表明沉默该基因并不改变大豆的表型，沉默GmCCOMT的表达能促进SMV的积累，因此可以通过上调该基因从而实现抗SMV的目的。本专利技术为改善大豆对大豆花叶病毒抗性的分子育种提供重要基因资源。
附图说明
[0008]图1为GmCCOMT在大豆不同组织中的表达情况；
[0009]图2为GmCCOMT对SMV的响应；
[0010]图3为GmCCOMT的氨基酸序列分析；其中，At1g67980为拟南芥CCOMT的氨基酸，Glyma05g27960为本专利技术GmCCOMT的氨基酸；a表示甲基转移酶；b表示S
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腺苷甲硫氨酸结合位点；
[0011]图4为大豆中沉默GmCCOMT基因的检测结果；
[0012]图5为沉默GmCCOMT的大豆植株形态学特征；
[0013]图6为沉默GmCCOMT的植物中SMV G7的累积；
[0014]图7为SilCCOMT植物中SMV病毒粒子ELISA分析结果；
[0015]图8为Rsv1 SilCCOMT植物SMV
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G7感染与系统性细胞死亡症状的相关性；
[0016]图9为SilCCOMT植物中木质素水平测定结果。
具体实施方式
[0017]下面将结合本专利技术的实施例和附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，绝不作为对本专利技术及其应用或使用的任何限制。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0018]一、GmCCOMT的组织表达分析
[0019]参照Trizol说明书从大豆不同组织中提取RNA，利用超微量分光光度计测定各组织RNA浓度和纯度，并利用1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，并将将28S和18S条带的亮度比例为2:1的总RNA利用反转录酶(TIANScript RT Kit)反转录成cDNA。设计GmCCOMT特异性荧光定量引物，以大豆组成型表达的Tubulin基因为内部参照，使用TAKARA的Premix Ex TaqTM PCR试剂盒，反应体系：SYBRMIX 10μl；Forward primer 0.5μl；Reverse primer0.5μl；ddH2O 8.2μl；cDNA0.8μl。反应条件：50℃2min,95℃10min，95℃20s，60℃1min，40个循环。每个样品做3次生物学重复。相对定量(2
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ΔΔCT
)方法对基因表达进行定量。如图1所示，荧光定量PCR显示，GmCCOMT在根、茎、子叶、叶、花中均有表达，且在茎和花中表达量最高。
[0020]二、GmCCOMT对SMV的响应
[0021]采用汁液摩擦接种的方法，将SMV G5接种于大豆感病品种南农1138
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2上进行扩繁。当供试豆苗第一对真叶完全展开时，取南农1138
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2上症状典型的叶片加入0.1M、pH 7.3～7.4的磷酸缓冲液(约每1g新鲜叶片加5ml缓冲液)，再加少许金刚砂(600目)在研钵中研成匀浆，用毛刷将匀浆涂到第一对展开的真叶上，然后用自来水冲洗此为实验组；对照组是利用摩擦方法接种磷酸缓冲液PBS。采集0dpi(取接种病毒前的叶片为0dpi，作为对照)和4dpi叶片提取RNA并反转录为cDNA，进行荧光定量分析。结果如图2所示，与对照相比，GmCCOMT的表达量明显上调，表明SMV病毒侵染诱导了GmCCOMT基因的上调表达。
[0022]三、大豆中沉默GmCCOMT基因
[0023]对GmCCOMT的氨基酸序列与模式作物拟南芥中的CCOMT At1g67980进行比对，如图
3所示，两条序列含有62％的相似性，且含有I类蛋白质S
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腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的两个保守位点，甲基转移酶(如图3中a所示)以及S
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腺苷甲硫氨酸结合位点(如图3中b所示)。为了研究GmCCOMT的功能，基于菜豆豆荚斑驳病毒(BPMV)介导的VIGS体系,选取含有保守S
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腺苷甲硫氨酸结合位点的区域来构建沉默载体(S33
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E98)。以南农1138...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大豆甲基转移酶基因GmCCOMT，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。2.一种如权利要求1所述的大豆甲基转移酶基因GmCCOMT的应用，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵龙刚，栾鹤翔，宋代巧，黄凯，
申请(专利权)人：东营青农大盐碱地高效农业技术产业研究院，
类型：发明
国别省市：