一种重组枯草芽孢杆菌及谷胱甘肽的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种重组枯草芽孢杆菌及谷胱甘肽的制备方法，采用过表达双功能谷胱甘肽合成酶基因的枯草芽孢杆菌基因工程菌株发酵生产所述的谷胱甘肽，不仅谷胱甘肽产量高、得率高，而且操作简单、方便，同时该方法以食品级枯草芽孢杆菌作为生产菌株，更加安全、可靠，为工业化绿色生产谷胱甘肽提供了有效的参考和借鉴。鉴。

【技术实现步骤摘要】
一种重组枯草芽孢杆菌及谷胱甘肽的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种重组枯草芽孢杆菌及谷胱甘肽的制备方法。

技术介绍

[0002]谷胱甘肽(γ
‑
L
‑
glutamyl
‑
cysteinyl
‑
glycine，GSH)是由L
‑
谷氨酸、L
‑
半胱氨酸和甘氨酸三种氨基酸缩合而成的一种活性三肽类化合物，广泛存在于各种生物体内。还原型的谷胱甘肽在活组织中具有许多重要的功能，谷胱甘肽能够提高人体免疫力，具有抗衰老的功效，其在老人迟缓化的细胞上所发挥的功效比年轻人大，谷胱甘肽对于治疗放射线、放射性药物所引起的白细胞减少等症状也都具有非常显著的效果。
[0003]目前谷胱甘肽的制备方法很多，常见的包括溶剂萃取法、化学合成法、生物发酵法和酶法。目前国内外生产谷胱甘肽主要是是采用发酵法或酶法，发酵法主要是将编码合成谷胱甘肽酶系或者双功能酶的基因克隆到细菌或酵母中，发酵培养获得谷胱甘肽，发酵法中酵母发酵法工艺较成熟。专利CN201810844388和CN201680013630分别在酵母和大肠杆菌中外源表达谷胱甘肽合成双功能酶基因，达到发酵生产谷胱甘肽的目的，但是产量很低，不适合批量化生产。并且还原性谷胱甘肽在医药保健、食品化妆品等领域有着广泛的应用，安全性至关重要，因此还需保证生产的谷胱甘肽足够安全、可靠。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种具有高产量、高得率的谷胱甘肽的制备方法。
[0005]为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0006]本专利技术第一方面提供一种谷胱甘肽的制备方法，采用过表达双功能谷胱甘肽合成酶基因的重组枯草芽孢杆菌基因工程菌株发酵生产所述的谷胱甘肽。
[0007]优选地，所述的双功能谷胱甘肽合成酶基因为来源于Streptococcus thermophilus的gshFst基因，所述的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]在本专利技术中，所述的双功能谷胱甘肽合成酶基因可通过常规基因工程手段获得。例如可以Streptococcus thermophilus DNA为模板通过PCR扩增分离得到，也可根据其序列通过人工合成得到。
[0009]优选地，采用补料分批发酵法生产所述的谷胱甘肽。
[0010]优选地，生产所述的谷胱甘肽时添加谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸。
[0011]优选地，添加的所述的谷氨酸、所述的甘氨酸、所述的半胱氨酸在反应体系中的初始浓度分别为80～120mM，进一步优选为90～110mM，更优选为95～105mM。
[0012]本专利技术通过高密度培养以及过表达双功能谷胱甘肽合成酶基因，将外援添加的谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸合成谷胱甘肽，从而达到高产量、高得率。
[0013]优选地，将所述的枯草芽孢杆菌基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵培养，在发酵培养的同时分批添加补料液，并控制发酵培养的温度为35～40℃，pH为6.5～7.5，发
酵培养至OD600为45～55；然后加入诱导剂继续培养至OD600为60～70，再加入谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸，继续培养至所述的谷胱甘肽的产量不再增加。
[0014]在本专利技术中，上述发酵培养过程中，发酵培养时间为25～35h，OD600达到45～55；加入诱导剂后继续培养8～12h，OD600达到60～70。
[0015]在本专利技术中，谷氨酸棒杆菌基因工程菌扩大培养方法如下所示：
[0016]A.平板培养：将甘油管保存的谷氨酸棒杆菌基因工程菌接种至LB培养基中，30℃培养8
‑
12h得到一级种子。
[0017]B.液体种子培养：将平板培养的谷氨酸棒杆菌基因工程菌(一级种子)接种至二级种子培养基中，30℃培养6
‑
13h得到二级种子培养液。在本专利技术中，种子培养基为LB液体培养基。
[0018]进一步优选地，控制所述发酵培养时的接种量为5％～20％，更优选为7％～10％。
[0019]在本专利技术中，将二级种子培养液按5％～20％的接种量接种至发酵罐中的发酵培养基中。
[0020]在本专利技术中，使用的诱导剂为IPTG，IPTG的浓度为1mmol/L。
[0021]根据一种实施方式，发酵培养的发酵培养基包括如下组分：碳源5～20g/L、氮源2～8g/L、无机盐及微量元素1.5～35g/L、可选择性地添加的生长因子5～50μg/L，其中，所述的碳源为玉米粉、玉米浆、糖蜜、蔗糖、葡萄糖、甘油、糊精中的一种或多种；所述的氮源为牛肉膏、工业蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、蛋白胨、尿素中的一种或多种；所述的无机盐及微量元素为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、氯化铵、氯化钾、氯化钠、氯化镁、碳酸钙、硫酸铵、硫酸镁、硫酸锰中的一种或多种；所述的生长因子为生物素、维生素B1、维生素B6中的一种或多种。
[0022]根据一种实施方式，所述的补料液的组分包括葡萄糖、酵母抽提物、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、胰蛋白胨、玉米浆、硫酸镁、甘油中的一种或多种，所述的补料液的浓度为400～520g/L。
[0023]本专利技术第二方面还提供一种重组枯草芽孢杆菌基因工程菌株的制备方法，包括如下步骤：
[0024](1)将来源于Streptococcus thermophilus的gshFst基因克隆到pHT
‑
43质粒上，得到重组质粒；
[0025](2)将所述的重组质粒转化谷氨酸棒杆菌，得到所述的谷氨酸棒杆菌基因工程菌。
[0026]在本专利技术中，所述的双功能谷胱甘肽合成酶基因可通过常规基因工程手段获得。
[0027]优选地，所述的步骤(1)的具体方法为：以质粒pET28a
‑
gshFst为模板进行DNA的扩增，然后将扩增产物或质粒采用BamHI和PstI进行双酶切，再与经BamHI和PstI酶切处理后的所述的pHT
‑
43质粒进行连接，得到所述的重组质粒。
[0028]在本专利技术中，所述的重组质粒通过电转的方法转入到枯草芽孢杆菌中。
[0029]本专利技术第三方面还提供一种重组枯草芽孢杆菌基因工程菌株，所述的枯草芽孢杆菌中过表达双功能谷胱甘肽合成酶的基因，所述的枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis str.168。
[0030]优选地，所述的双功能谷胱甘肽合成酶基因为来源于Streptococcus thermophilus的gshFst基因，所述的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述的双功能谷胱甘肽
合成酶基因可通过常规基因工程手段获得。
[0031]使用本专利技术的重组枯草芽孢杆菌，通过发酵法生产谷胱甘肽，不仅操作简单、方便，而且产量高、得率高，符合节约资源以及环境友好的生产理念，为重组枯草芽孢杆菌工业化生产谷胱甘肽提供了参考和借鉴。
[0032]本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种谷胱甘肽的制备方法，其特征在于：采用过表达双功能谷胱甘肽合成酶基因的重组枯草芽孢杆菌基因工程菌株发酵生产所述的谷胱甘肽。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的双功能谷胱甘肽合成酶基因为来源于Streptococcus thermophilus的gshFst基因，所述的基因序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：采用补料分批发酵法生产所述的谷胱甘肽。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：生产所述的谷胱甘肽时添加谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸，且添加的所述的谷氨酸、所述的甘氨酸、所述的半胱氨酸在反应体系中的初始浓度分别为80～120mM。5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于：将所述的枯草芽孢杆菌基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵培养，在发酵培养的同时分批添加补料液，并控制发酵培养的温度为35～40℃，pH为6.5～7.5，发酵培养至OD600为45～55；然后加入诱导剂继续培养至OD600为60～70，再加入谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸，继续培养至所述的谷胱甘肽的产量不再增加。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：控制所述发酵培养时的接种量为5％...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦建国，王德正，李志敏，刘世领，
申请(专利权)人：上海青平药业有限公司，
类型：发明
国别省市：