一种在CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG纯化工艺制造技术

本申请涉及重组蛋白领域，尤其涉及一种在CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG纯化工艺，包括在亲和洗脱液中加入二硫苏糖醇和β

【技术实现步骤摘要】
一种在CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG纯化工艺


[0001]本申请涉及重组蛋白领域，尤其涉及一种在CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG纯化工艺。

技术介绍

[0002]人绒毛膜促性腺激素(hCG)由胎盘滋养细胞合成的激素，由α亚基、β亚基组成，目前广泛用于治疗女性不孕、性机能障碍、流产、侏儒症、皮肤瘙痒、皮痒、肿瘤等疾病。
[0003]hCG最早以孕妇尿液为原料，通过沉淀、离子交换层析等方法制备，含较多杂质、来源不确定、有传染疾病风险以及批间差异、易发生过敏反应等，在临床使用中存在风险。之后研究者把研发重点放在了利用重组技术制备和生产，并在临床上逐渐取代尿源HCG。
[0004]虽然有昆虫细胞、神经细胞等宿主的尝试，但目前rhCG生产中最常用的细胞仍然为CHO细胞。但CHO细胞中蛋白质的表达调控机理、蛋白质翻译后修饰调控系统、细胞生长代谢调控机制等环节仍然缺少深入认识，所以在外源基因的整合策略、高表达菌株的筛选、高效培养基配置、培养工艺调控等方面的理论指导水平都还比较低，相关研究都更多地依赖大量的优化筛选和优化实验来获得较优的操作条件。不仅研究和生产效率低、耗时长、成本高，而且受偶然性因素影响较大。虽然国外先进企业已经通过开发谷氨酰胺合成酶(GS)系统、定制无血清个性化培养基、优化高密度微载体培养工艺和补料策略、应用低成本和低剪切力生物反应器等手段，rhCG的高水平表达仍然需要较长的培养时间(＞20天)和较高的生产成本。
[0005]虽然rhCG与u
‑
HCG具有基本相同的分子结构和药理药代特点，但rhCG在纯度、效价和安全性等方面较u
‑
HCG具有较大的优势。rhCG存在于CHO细胞的培养液中，培养液中存在多种杂质，须通过有效的分离纯化方法去除，才能获得纯度、比活和安全性达到药典要求的重组蛋白。目前常用的纯化方法也是多种层析和膜过滤方法的组合。应用研究系统股份公司(ARS)采用C4硅胶、DEAE琼脂糖凝胶、CM琼脂糖凝胶和C18反相层析，再利用超滤浓缩并去除小分子杂质，最后利用凝胶过滤层析去除及游离的α和β亚基。
[0006]虽然目前已经实现了rhCG的商品化生产，并且相关产品已经在临床得到了多年应用，但rhCG的生产技术仍存在一些亟待解决的问题。
[0007](1)以CHO细胞为代表的哺乳动物细胞的大规模培养过程存在技术难度大、培养周期长、蛋白表达水平有限、生产成本高等不足。
[0008]CHO细胞中蛋白质的表达调控机理、蛋白质翻译后修饰调控系统、细胞生长代谢调控机制等环节仍然缺少深入认识，所以在外源基因的整合策略、高表达菌株的筛选、高效培养基配置、培养工艺调控等方面的理论指导水平都还比较低，相关研究都更多地依赖大量的优化筛选和优化实验来获得较优的操作条件。不仅研究和生产效率低、耗时长、成本高，而且受偶然性因素影响较大。虽然国外先进企业已经通过开发谷氨酰胺合成酶(GS)系统、定制无血清个性化培养基、优化高密度微载体培养工艺和补料策略、应用低成本和低剪切力生物反应器等手段，使重组蛋白的表达水平达到了较高水平，但仍然需要较长的培养时
间(＞20天)和较高的生产成本。
[0009](2)重组蛋白的分离纯化过程复杂、生产成本高等不足。
[0010]虽然重组蛋白的浓度在CHO细胞培养液中的浓度已达到了较高水平，但培养液中各种杂质的浓度仍然较高，分离纯化的难度依然较大，必须通过反复利用多种层析和膜过滤操作，才能使产物的纯度、比活和安全性达到药典要求。因此，大约50～70％的成本仍然产生于重组蛋白的分离纯化工序。
[0011]目前，在rhCG产品的研发和生产方面出现了一些新的技术，以提高产品的生物效价、生产效率和产品纯度。这些技术体现并指明了包括rhCG在内的重组糖蛋白药物研发和生产的研究趋势。
[0012]如在rhCG中引入分离因素，为高效分离纯化方法的使用创造条件，从而简化rhCG的分离纯化步骤、提高分离纯化效率、减低分离纯化成本。广州优联康医药科技有限公司申报并获得授权的专利ZL 201310617181.8中披露了一种制备hCG与人IgG Fc变体片段的融合蛋白的方法，利用融合的无免疫活性的IgG Fc变体片段进行hCG的亲和层析，只需2步层析过程即可获得纯度大于98％的重组蛋白。类似的，也可以尝试在hCG的结构中引入其他不破坏活性的分离因子，为高效分离方法的应用创造条件。

技术实现思路

[0013]本专利技术的一个目的在于提供一种在CHO细胞中表达的重组蛋白hCG纯化工艺，对亲和洗脱液和漂洗液进行改进，在亲和洗脱液中加入二硫苏糖醇和β
‑
巯基乙醇，在漂洗液中加入EDTA金属螯合剂，防止蛋白氧化和防止重金属对目标蛋白的破坏，得到纯度高的产物。本专利技术的另一个目的是提供一种对发酵混合培养基和补料培养基进行改进，同时对亲和洗脱液和漂洗液进行改进，得到纯度高的产物。
[0014]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0015]一种在CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG纯化工艺，包括在亲和洗脱液中加入二硫苏糖醇和β
‑
巯基乙醇，在漂洗液中加入EDTA金属螯合剂。
[0016]作为优选，纯化工艺包括发酵液处理、亲和层析、超滤、病毒灭活、离子层析、疏水层析、羟基磷灰石层析、病毒过滤和无菌过滤；所述的亲和层析层析柱的填料为blue填料。
[0017]作为优选，亲和洗脱液包括20mmol/L Tris、1.5mol/L氯化钠、0.5mmol/L二硫苏糖醇、0.5mmol/Lβ
‑
巯基乙醇和5％乙醇，PH为7.5
±
0.2。
[0018]作为优选，亲和层析中使用的漂洗液中包括20mmol/L Tris、300mmol/L氯化钠、5mmol/L EDTA金属螯合剂，pH为7.5
±
0.2。
[0019]作为优选，亲和层析的层析柱直径350mm，柱高15
±
2cm，线性流速100
‑
250cm/h。
[0020]作为优选，所述的发酵液处理：细胞液下罐后，加入氯化锌溶液，室温放置一段时间后用离心机离心或深层过滤，然后用缓冲液顶洗，离心后的溶液用不同规格的聚醚砜滤芯前后串联过滤，收获后的溶液作为亲和层析上样样品。
[0021]作为优选，所述离子交换层析：层析柱直径72mm，柱高15
±
2cm，线性流速100
‑
250cm/h。
[0022]作为优选，所述疏水层析：层析柱直径72mm，柱高15
±
2cm，线性流速50
‑
150cm/h；所述的羟基磷灰石层析：层析柱直径40mm，柱高15
‑
20cm，线性流速50
‑
150cm/h。
[0023]一种使用CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG的制备工艺，包括CHO细胞表达rhCG的发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG纯化工艺，其特征在于包括在亲和洗脱液中加入二硫苏糖醇和β
‑
巯基乙醇，在漂洗液中加入EDTA金属螯合剂。2.根据权利要求1所述的重组蛋白rhCG纯化工艺，其特征在于纯化工艺包括发酵液处理、亲和层析、超滤、病毒灭活、离子层析、疏水层析、羟基磷灰石层析、病毒过滤和无菌过滤；所述的亲和层析层析柱的填料为blue填料。3. 根据权利要求1所述的重组蛋白rhCG纯化工艺，其特征在于亲和洗脱液包括20mmol/L Tris、1.5mol/L氯化钠、0.5 mmol/L二硫苏糖醇、0.5 mmol/L β
‑
巯基乙醇和5%乙醇，PH为 7.5
±
0.2。4.根据权利要求2所述的重组蛋白rhCG纯化工艺，其特征在于亲和层析中使用的漂洗液中包括20mmol/L Tris、300mmol/L氯化钠、5 mmol/L EDTA金属螯合剂，pH为7.5
±
0.2。5.根据权利要求2所述的重组蛋白rhCG纯化工艺，其特征在于亲和层析的层析柱直径350mm，柱高15
±
2cm，线性流速100
‑
250cm/h。6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏星辉，胡晶晶，高乃波，
申请(专利权)人：宁波人健药业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：