一种重组人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂及其制备方法技术

本申请涉及重组蛋白领域，一种重组人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂及其制备方法。一种人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂，由包括人绒毛膜促性腺激素、至少一种赋形剂和至少一种PH调节剂经冻干工艺制备得到。本发明专利技术人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂，采用蔗糖作为冻干赋形剂，在适当的PH条件下进行冻干，得到的冻干产品外观饱满，支撑结构良好。支撑结构良好。支撑结构良好。

【技术实现步骤摘要】
一种重组人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂及其制备方法


[0001]本申请涉及重组蛋白领域，尤其涉及一种重组人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂及其制备方法。

技术介绍

[0002]hCG的研究和应用最早可追溯至二十世纪三十年代。一直以来以孕妇尿液为原料，通过沉淀、离子交换层析等方法制备。含较多杂质、来源不确定、有传染疾病风险以及批间差异、易发生过敏反应等，在临床使用中存在风险，之后研究者把研发重点放在了利用重组技术制备和生产，并在临床上逐渐取代尿源HCG。
[0003]虽然rhCG与u
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HCG具有基本相同的分子结构和药理药代特点，但rhCG在纯度、效价和安全性等方面较u
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HCG具有较大的优势。rhCG存在于CHO细胞的培养液中，培养液中存在多种杂质，须通过有效的分离纯化方法去除，才能获得纯度、比活和安全性达到药典要求的重组蛋白。目前常用的纯化方法也是多种层析和膜过滤方法的组合。应用研究系统股份公司(ARS)采用C4硅胶、DEAE琼脂糖凝胶、CM琼脂糖凝胶和C18反相层析，再利用超滤浓缩并去除小分子杂质，最后利用凝胶过滤层析去除及游离的α和β亚基，并获得了相关专利(EP 2001/000665、ZL 01805363.7)。
[0004]根据文献报道信息：上市药品重组绒促性素的粉针制剂处方组成为每支含有285微克重组绒促性素、30mg蔗糖、0.98mg磷酸和氢氧化钠(用于pH调节)。复溶的pH值为6.5至7.5。另外，上市重组绒促性素粉针制剂中用到的辅料是磷酸和氢氧化钠作为缓冲体系维持PH值范围。在注射剂中所用的辅料越少，溶液中的离子根的种类越少，制剂潜在的未知风险就越小。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是在于提供一种稳定性好、有关物质少的重组人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供一种重组人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂的制备方法。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂，由包括人绒毛膜促性腺激素、至少一种赋形剂和至少一种PH调节剂经冻干工艺制备得到。
[0008]进一步的，所述的赋形剂是蔗糖。进一步的，所述的PH调节剂是由一水磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。进一步的，所述的一水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠的重量百分比为1：1.6。进一步的，所述PH调节剂将复溶后的PH控制在6.5至7.5。进一步的，所述的人绒毛膜促性腺激素是使用CHO细胞中发酵表达的重组蛋白rhCG并经纯化获得。进一步的，所述的使用CHO细胞中发酵表达的发酵混合培养基中加入氯化锰，在补料培养基中加入氢化可的松和焦磷酸钠。
[0009]一种人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂的制备工艺，包括溶液配制、除菌过滤、灌装、冷冻干燥，除菌过滤采用0.22微米的聚醚砜材质的2.5英寸滤芯。进一步的，所述的人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂的制备工艺，其特征在于溶液配制时，1000ml溶液中包括人绒毛膜促性腺激素500毫克、一水磷酸二氢钠1.076mg、磷酸氢二钠1.732mg，加注射用水至1000ml。进一步的，一种人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂的制备工艺，冷冻干燥的工艺参数为：预冻：板层温度
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40～
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50℃；全速降温；维持时间2
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4小时；第一次升华：真空度小于20Pa，1小时内升温至
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25～
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32℃℃，保持30
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40小时，真空度控制在10Pa
±
2Pa；第二次升华：1小时内升温至0℃，恒温保温5
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10小时，真空度控制在20Pa
±
2Pa，1小时内升温至32℃，真空度控制在20Pa
±
2Pa，恒温保持5
‑
10小时。
[0010]本专利技术人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂，采用蔗糖作为冻干赋形剂，在适当的PH条件下进行冻干，得到的冻干产品外观饱满，支撑结构良好。而且采用一水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠以重量百分比1∶1.6的缓冲体系，使复溶后的溶液中的离子比较单一可控，从而规避了磷酸中未知杂质对产品的潜在风险。
[0011]本专利技术中人绒毛膜促性腺激素是用CHO细胞发酵获得，通过前期对发酵参数和细胞等因素的优化后，申请人尝试了对发酵混合培养基和补料培养基的改进，研究了多种特殊添加剂对CHO表达rhCG的影响，发现在培养基中加入锰离子、氢化可的松和焦磷酸钠可以有效提高rhCG表达水平，并通过纯化工艺，使其纯度达99％以上，符合药典的要求。
附图说明
[0012]图1：使用CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG的制备工艺图；
[0013]图2：为发酵培养第6日时hCG各亚基的相对丰度；
[0014]图3：对照品rhCG高效液相色谱图
[0015]图4：供试品rhCG高效液相色谱图；
[0016]图5：供试品和样品肽谱；
[0017]图6：rhCG冻干粉实物图。
具体实施方式
[0018]实施例1：使用CHO细胞发酵生产并纯化获得rhCG。
[0019]一、发酵所用的细胞、培养基及其他试剂：
[0020]发酵所用的CHO细胞为申请人自制，使用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂将携带rhCGα、β亚基的载体转染入CHO细胞K1株中制成，该细胞随后被无血清驯化并已经在申请人rhCG的试验性生产中运用超过18个月。
[0021]传代培养基：CD CHO AGT 24.3mg/ml、一水磷酸二氢2.69mg/ml、磷酸氢二钠4.33mg/ml、L
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精氨酸550mg/ml、L
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天冬酰胺1300mg/ml、L
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天冬氨酸400mg/ml；
[0022]发酵混合培养基：CD CHO AGT 24.3mg/ml、CD OPTICHO AGT 9.66mg/ml、一水磷酸二氢钠2.69mg/ml、磷酸氢二钠4.33mg/ml、生物素0.15mg/ml、叶酸11.5mg/ml、肌醇120mg/ml、氯化钾300mg/ml、葡萄糖5500mg/ml、氯化钠2100mg/ml、大豆水解蛋白30mg/ml；
[0023]补料培养基：BalanCD CHO Feee3 66mg/ml、一水磷酸二氢钠2.69mg/ml、磷酸氢二钠4.33mg/ml、L
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精氨酸2000mg/L、L
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天门冬氨酸4500mg/L、维生素C15mg/L、维生素H 5mg/L
叶酸30mg/L、肌醇400mg/L、维生素B12 5mg/L、氯化钾0.0015mg/L、F
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68 950mg/L、葡萄糖18000mg/L；
[0024]HCG ELISA试剂盒：日本东曹；MnCl2：济南凯创化工有限公司；CD CHO AGT：gibco；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂，由包括人绒毛膜促性腺激素、至少一种赋形剂和至少一种PH调节剂经冻干工艺制备得到。2.根据权利要求1所述的一种人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂，其特征在于所述的赋形剂是蔗糖。3.根据权利要求1所述的一种人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂，其特征在于所述的PH调节剂是由一水磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。4.根据权利要求3所述的一种人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂，其特征在于所述的一水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠的重量百分比为1：1.6。5.根据权利要求1所述的一种人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂，其特征在于所述PH调节剂将复溶后的PH控制在6.5至7.5。6.根据权利要求1任何一项所述的人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂，其特征在于所述的人绒毛膜促性腺激素是使用CHO细胞中发酵表达的重组蛋白rhCG并经纯化获得。7.根据权利要求6所述的人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂，其特征在于所述的使用CHO细胞中发酵表达的发酵混合培养基中加入氯化锰，在补料培养基中加入氢化可的松和焦磷酸钠。8.根据权利要求1~7任何一项所述的人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂的制备工艺，其特征在于包括溶液配制、除菌过滤、灌装、冷冻干燥，除菌过滤采用...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书一九页附图五页，
申请(专利权)人：宁波人健药业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：