本发明专利技术公开了一种蛋白质及其分离方法与应用，该蛋白质选自：i.由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；ii.与i类蛋白同源的蛋白；iii.i类蛋白的衍生蛋白；其分离方法包括(1)芸香科植物果实总蛋白的提取；(2)总蛋白的再次提取；(3)目标蛋白的粗提取。本发明专利技术首次分离出了芸香科植物中能够引起人体“上火”等炎症的蛋白质；该分离方法得到的最终精提取物，纯度高，利用该精提取物可以准确得出引起炎症的蛋白的氨基酸序列；另外，利用本方法中的精提取物或者中间粗提取物能够对芸香科植物果实是否具有引起炎症的效果进行定量判断，实用性好。
【技术实现步骤摘要】
一种蛋白质及其分离方法与应用
本专利技术属于植物蛋白分离
，更具体地，涉及一种蛋白质及其分离方法与应用，该蛋白质(即Citsh1蛋白)分离提取自温州蜜柑，是能够诱导人体“上火”等炎症反应的蛋白质。本专利技术利用葡聚糖凝胶和反向色谱分离的方法分离温州蜜柑果肉中的总蛋白，通过不同提取物对巨噬细胞系RAW264.7的处理，确定最终炎症因子环氧合酶2的转录水平变化，从而对分离后的产物进行筛选和功能验证。
技术介绍
温州蜜柑(C.unshiuMarcov.satsuma)原产中国浙江温州，具有“色艳、形美、果大、皮薄、无核、汁多”的优点，是鲜食、加工两用的优良品种(乔勇进,王海宏etal.2007)。同时温州蜜柑广泛的栽培也是大家喜爱的水果之一(Nelson,Campbelletal.2008)。温州蜜柑的果实含有大量的营养，尽管如此食用过量的温州蜜柑会导致“上火”现象，如食欲不振、舌炎、牙周炎、咽喉炎等导致机体紊乱。粉刺、小脓包、痔疮还有流鼻血都被认为与过度消费“上火”食物有关(Koo1984)。曾有报道指出7个经常喝大量橘汁的人容易口腔溃疡(Hicks1950)。可以说“上火”没有一个特异性的生理指标，应属于一种失去体内内环境稳定状态的身心疲劳综合症，并且“上火”与机体神经-内分泌-免疫系统有关系(何蓉蓉与栗原博2008)。根据中国传统的阴阳学说，人身体的健康被认为是阴阳的平衡，表现在“上火”和“降火”食物之间的平衡(LudmanandNewman1984)。“火”者，其性“炎”上(苗连绪与潘静2009)。通过这样可以将传统的中医“上火”概念和西方医学中炎症的概念联系在一起。所谓的炎症就是平时人们所说的“发炎”，是机体对于外界刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛、功能障碍等应激反应。任何能够引起组织损伤的因素都可成为引发炎症的原因，即致炎因子，而致炎因子的发生又会导致炎症因子的上调表达。因此检测炎症发生的效果便可以通过检测炎症因子含量的变化来判断。习惯上我们将一些含有热量高，糖分高的水果称为热性水果，这些热性水果的粗提物来研究其可能的抗炎和引起炎症的效果(HuangandWu2002)。尽管现有技术中已有对易引起人体上火反应的植物及其提取物的相关研究，但这些提取方法得到的提取物纯度不高，人们无法利用这些提取物得到准确的具体蛋白序列；另一方面，这些提取方法能够针对的植物也较为有限，以芸香科植物为例，芸香科植物的果实是国内消费普遍的水果之一，但芸香科植物由于其自身的特点，如果肉细胞中存在大量次生代谢物、糖、蛋白酶等物质，蛋白质相对含量较低。这些不利的因素都会导致蛋白质的提取效率较低。此外，由于不同的芸香科植物(如橘、柑、柚、橙、柠檬等)其引起炎症的效果不同，目前除了根据经验定性判断外，缺乏科学定量判断其引起炎症效果的手段。
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术的目的在于提供一种蛋白质及其分离方法与应用，其中通过对蛋白质分离方法中的手段及使用的参量(如使用的各种试剂的配比、含量，分离过程的操作等)进行改进，与现有技术相比，首次分离出了芸香科植物中能够引起人体“上火”等炎症的蛋白质；并且，该分离方法得到的最终精提取物，纯度高，利用该精提取物可以准确得出引起炎症的蛋白的氨基酸序列；另外，利用本方法中的精提取物或者中间粗提取物能够对芸香科植物果实是否具有引起炎症的效果进行定量判断，实用性好。为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种蛋白质，其特征在于，该蛋白质选自：i.由SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；ii.与SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列组成的蛋白质；iii.SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的衍生蛋白。作为本专利技术的进一步优选，该蛋白质提取自芸香科植物，并且会导致上火。按照本专利技术的另一方面，提供了一种蛋白质的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)芸香科植物果实预处理：首先将芸香科植物果实榨汁，将得到的果汁用纱布过滤得到滤液；然后，将所述滤液冷冻干燥得到固体粉末；(2)将所述步骤(1)得到的固体粉末通过酚提取法再次提取总蛋白得到蛋白粉末；接着，利用凝胶色谱柱法分离所述蛋白粉末得到目标蛋白的粗提取粉末，其中粗提取得到的目标蛋白粉末是收集第114分钟～第147分钟凝胶色谱柱分离液得到的。作为本专利技术的进一步优选，所述步骤(2)具体包括以下步骤：(2-1)总蛋白的再次提取：在0℃下向5～7mL的酚提取缓冲液中加入5g所述步骤(1)中得到的固体粉末，配制所述酚提取缓冲液的原料包括蔗糖、EDTA、PMSF、DTT、TritonX-100和pH值为7.5的Tris-HCl，该酚提取缓冲液中Tris的浓度为20mmol/L，蔗糖的浓度为250mmol/L，EDTA的浓度为10mmol/L，PMSF的浓度为1mmol/L，DTT的浓度为1mmol/L，TritonX-100的质量百分浓度为1％；接着再向其中加入5mL饱和酚溶液，混合后离心处理，得到水相上层、白色杂质中间层以及酚层下层；然后，回收该酚层下层作为收集液，接着向该收集液中加入4倍～5倍体积醋酸胺浓度为0.1mol/L的甲醇溶液，并在-20℃下静置12h，得到蛋白沉淀；然后将该沉淀用丙酮清洗后干燥得到蛋白粉末；(2-2)目标蛋白的粗提取：将所述步骤(2-1)中的蛋白粉末配制成浓度为5mg/mL的蛋白水溶液，取8mL所述蛋白水溶液作为试样；接着，利用凝胶色谱柱分离该蛋白水溶液试样，控制流速为1mL/min，然后按时间依次收集100管层析液，每管收集3min，其中第38管～第49管层析液冷冻干燥即得到目标蛋白的粗提取粉末。作为本专利技术的进一步优选，所述步骤(2)还包括步骤(2-3)目标蛋白的精提取：将所述步骤(2-2)得到的目标蛋白粗提取粉末配制成100μL浓度为10mg/mL的上样液；然后，通过高效液相色谱法利用流动相分离该上样液并按时间依次收集分离液，所述流动相是由浓度为0.05％的三氟乙酸的乙腈溶液和浓度为0.1％的三氟乙酸的水溶液按体积比10:90配制而成；具体是将所述上样液溶解在所述流动相中，并通过半制备型COSMOILC18的柱子，该柱子的温度为30℃；接着，将其中第4.5分钟～第5.0分钟收集到的所述分离液透析去除其中的流动相和无机盐，然后冷冻干燥浓缩即得到目标蛋白的精提取粉末。作为本专利技术的进一步优选，所述步骤(1)中芸香科植物果实为果肉，该果肉是将所述芸香科植物果实去皮，并剥掉果肉外的白皮层得到的。作为本专利技术的进一步优选，所述步骤(2-2)中的凝胶色谱柱填料采用SephadexG-200。作为本专利技术的进一步优选，所述步骤(2-3)中的所述三氟乙酸的乙腈溶液和所述三氟乙酸的水溶液均经过0.22μm滤膜过滤除菌。作为本专利技术的进一步优选，所述步骤(2-2)得到的目标蛋白的粗提取粉末或所述步骤(2-3)得到的目标蛋白的精提取粉末包含有如权利要求1或2所述的蛋白质。按照本专利技术的另一方面，提供了一种上述蛋白质分离方法在上火鉴定的应用，其特本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白质，其特征在于，该蛋白质选自：i.由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；ii.与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列组成的蛋白质；iii.SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的衍生蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，其特征在于，该蛋白质选自：i.由SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；ii.与SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列组成的蛋白质；iii.SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的衍生蛋白。2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，该蛋白质提取自芸香科植物，并且会导致上火。3.一种蛋白质的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)芸香科植物果实预处理：首先将芸香科植物果实榨汁，将得到的果汁用纱布过滤得到滤液；然后，将所述滤液冷冻干燥得到固体粉末；(2)将所述步骤(1)得到的固体粉末通过酚提取法再次提取总蛋白得到蛋白粉末；接着，利用凝胶色谱柱法分离所述蛋白粉末得到目标蛋白的粗提取粉末，其中粗提取得到的目标蛋白粉末是收集第114分钟～第147分钟凝胶色谱柱分离液得到的。4.如权利要求3所述蛋白质的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括以下步骤：(2-1)总蛋白的再次提取：在0℃下向5～7mL的酚提取缓冲液中加入5g所述步骤(1)中得到的固体粉末，配制所述酚提取缓冲液的原料包括蔗糖、EDTA、PMSF、DTT、TritonX-100和pH值为7.5的Tris-HCl，该酚提取缓冲液中Tris的浓度为20mmol/L，蔗糖的浓度为250mmol/L，EDTA的浓度为10mmol/L，PMSF的浓度为1mmol/L，DTT的浓度为1mmol/L，TritonX-100的质量百分浓度为1％；接着再向其中加入5mL饱和酚溶液，混合后离心处理，得到水相上层、白色杂质中间层以及酚层下层；然后，回收该酚层下层作为收集液，接着向该收集液中加入4倍～5倍体积醋酸胺浓度为0.1mol/L的甲醇溶液，并在-20℃下静置12h，得到蛋白沉淀；然后将该沉淀用丙酮清洗后干燥得到蛋白粉末；(2-2)目标蛋白的粗提取：将...
【专利技术属性】
技术研发人员：马兆成，闫慧清，王小丽，邓秀新，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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