【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子检测，具体涉及一组与克氏原螯虾wssv耐受相关的snp分子标记及其应用。
技术介绍
1、克氏原螯虾俗称小龙虾。近年来，克氏原螯虾养殖规模日益壮大，成为重要的淡水经济虾类。流行病学调查显示，不同地区、不同养殖模式的克氏原螯虾普遍携带wssv，且全年均能检测到wssv携带个体，威胁克氏原螯虾健康养殖。虾蟹一旦感染wssv，3-10d内死亡率高达80％-100％。
2、脊椎动物的免疫系统包括先天性免疫和适应性免疫，而无脊椎动物缺乏t、b淋巴细胞，因此，它们无法通过高度专一的适应性免疫来抵御病原入侵。氧化还原系统在保护克氏原螯虾免受病原侵害，提升病毒耐受能力中发挥着重要作用。ho-1是nrf2下游的靶蛋白,能降解血红素释放胆绿素、co和fe2+。
3、荧光素酶报告基因系统是指通过定量荧光素酶催化荧光素氧化为氧化荧光素所发出的生物荧光来间接筛选影响目的基因表达的潜在调控因子并定量其调控活性的一种方法。构建一个将靶基因启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pgl3-basic等，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。传统荧光素酶报告载体没有插入完整目的基因的非翻译区，只是截取一小段序列构建至荧光素酶基因的上游，这种结构组成和体内真实情况存在较大差别，因此筛选出的调控因子往往不能在体内生理状态下发挥作用。
4、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snps)是指在基因dna序列中由单个a、t、c、g发生而引起的序列多态性。
技术实现思路
1、本专利技术解决的问题在于通过克氏原螯虾ho-1基因的点突变荧光素酶报告载体所显示的活性差异来验证它们与克氏原螯虾耐受wssv的关联分析结果，进一步验证其是否可以作为克氏原螯虾分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快克氏原螯虾耐受wssv品种的选育进程。
2、本专利技术结合全基因组重测序数据开发ho-1基因snp位点，并构建插入完整目的基因的非翻译区的pgl3-ho-1pro载体，由bsa测序结果在克氏原螯虾ho-1基因5'端调控区发现了12个snp突变位点，其中11个snp位点在克氏原螯虾群体中与wssv耐受显著相关。经ho-1基因的点突变荧光素酶报告载体转录活性检测，筛选出4个与wssv耐受性状相关的有利snp分子标记。
3、本专利技术是通过以下技术方案来实现：
4、克氏原螯虾ho-1基因的点突变荧光素酶报告载体转录活性的检测方法包括以下步骤：
5、(1)以包含ho-1基因的克氏原螯虾全基因组dna为模板，使用引物对p来扩增克氏原螯虾ho-1基因5'端调控区；
6、(2)对步骤(1)的扩增产物进行pcr产物的切胶回收及纯化；
7、(3)用限制性内切酶nhei和xhoi分别消化步骤(2)的纯化产物和荧光素酶报告基因载体pgl3-basic质粒；
8、(4)将步骤(3)中的消化产物经切胶回收及纯化；
9、(5)使用t4dna连接酶将步骤(4)中的纯化产物进行连接；
10、(6)将步骤(5)中的连接产物转化dh5α大肠杆菌感受态细胞中，挑取的单克隆通过菌液pcr、双酶切鉴定以及测序三重验证；
11、质粒pgl3-ho-1pro表示将启动子区域正确插入报告基因质粒(pgl3-basic)中的重组质粒(小写字母gtaccgagctcttacgcgtg为pgl3-basic质粒部分序列，大写字母为启动子区域,带下划线atg为启动子,带下划线为启动子第一个字母向调控区方向的突变位点)，其信息如下：
12、gtaccgagctcttacgcgtgttagtgccagagctatgctgtgaggatagatttaaggaactggacctcacaaaaacagacgacagaagaaacagggaagatatgatcacaaatatacaaaatactgatgggaatagacaaggtggacaaggacagcctctttaagttaagagaaagcagaacaagaggaaagtggaaacaaatgagttgaatataaggaaatactgaacaaatataccctgtacaaatggaatgcattaggacgtaatgtggtggaggcaaactccatagtttcaaattagatatgattgagtccaacacgtacaggagcctacgcatcagttgattgccggttgtgaggcggagccaaagaaccgaagctcaacctccgaaagcccaattaggtgtgtactgtgtacagttctacatcgcacagatgtctccgccccgacctgtatcgtatccaaaattcccgcctcacatttcccattcttagcggccgtggcctgaaggatgaaccgcgttacgtcgtcctgtgtctgacgttccgctccctgcaggccacacatagacgtctgtaaccagtgcgggtcgggcctgtagggcatcctacttgttcgtctggattctttaactacaagctcgatatttttttctaccacagacgtcgccatacattaacaatgctaaccagcatatttacattttcttctatcctacatggacagggttagagatttgtcaaacatacagtgtatggatttattgaataatcaaccacagaaggtgattgtagtgcttttaaaatgctaggctaagctacatacgtagttagtttagtttagttcatttattatgcaccccatacccatcctgtgggcggtagtggaaagggttacagaggcacataatgggctcagggactgaaccccacaattcatttagctaagcaagttacaatcttgatgagctagttacaaaattcaatataagtcatcacatcaacaatgggttcgagatcgacctcaagtacaggttctaaattaagcaactgacatatgtggagagctagtgtcaaaatttatatgtttgtcctgcacaccgccccccatccagtgggcagcggtggataggttacaatcacttagttactacctacagttagcaaactggggatatttggctaaaatttctggtagcagatcattttgaatgaaatattgacacatcgctggaacattggttat本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.克氏原螯虾中与WSSV耐受和/或抗氧化能力相关的SNP分子标记，其特征在于，包括：位于克氏原螯虾HO-1基因5'端调控区的-1775C>A、-2117T>C、-2164A>T或-2197G>T，其依次分别位于SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第464位、第122位、第75位、第42位处。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，当SEQ ID NO:1所示序列的第464位为A、和/或第122位为C、和/或第75位为T、和/或第42位为T时，克氏原螯虾个体表现出更为耐受WSSV和/或高抗氧化能力的性状。
3.用于检测权利要求1-2任一所述SNP分子标记的引物组，其特征在于，包括如SEQ IDNO:2-5所示的引物：PcHO-1proF1:AGCCCAAGCTACCATGATA AG，PcHO-1proR1:GAACTGTACACAGTACACACC；PcHO-1proF2:TTAGTGC CAGAGCTATGCTGTGA，PcHO-1proR2:TCTCTGGTAACATCTCGCAT。
4.一种用于检
5.权利要求1-2任一所述SNP分子标记、权利要求3所述引物组或权利要求4所述试剂盒在如下任一中的应用：
6.一种鉴定、筛选和/或培育克氏原螯虾耐受WSSV和/或高抗氧化能力品种的方法，其特征在于，利用权利要求3所述引物组或权利要求4所述试剂盒对样本进行权利要求1-2任一所述SNP分子标记的检测，选取检测结果为-1775C>A、-2117T>C、-2164A>T或-2197G>T中的任意一种或多种，得到更为耐受WSSV性状和/或高抗氧化能力的克氏原螯虾个体或亲本。
...【技术特征摘要】
1.克氏原螯虾中与wssv耐受和/或抗氧化能力相关的snp分子标记，其特征在于，包括：位于克氏原螯虾ho-1基因5'端调控区的-1775c>a、-2117t>c、-2164a>t或-2197g>t，其依次分别位于seq id no:1所示核苷酸序列的第464位、第122位、第75位、第42位处。
2.根据权利要求1所述的snp分子标记，其特征在于，当seq id no:1所示序列的第464位为a、和/或第122位为c、和/或第75位为t、和/或第42位为t时，克氏原螯虾个体表现出更为耐受wssv和/或高抗氧化能力的性状。
3.用于检测权利要求1-2任一所述snp分子标记的引物组，其特征在于，包括如seq idno:2-5所示的引物：pcho-1prof1:agcccaagctaccatgata ag，pcho-1pror1:gaactgtac...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁军法，孙兴烨，黎嘉豪，董培庠，李莉娟，王江华，顾泽茂，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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