【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药。更具体地，涉及一种磁性基因工程化细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
1、癌症是一个重大的公共卫生问题，原发性肿瘤的转移占癌症相关高死亡率的近90％。目前，癌症诊断的金标准是组织活检，其存在取样困难，患者痛苦大，不适合反复取样等缺点。液体活检是一种非侵入性的诊断技术，通过分析体液中的生物标志物来确定疾病的进展情况。由于在癌症进展过程中，肿瘤细胞可以从原发肿瘤的细胞外基质中分离出来并进入循环系统，成为循环肿瘤细胞。因此，循环肿瘤细胞可作为液体活检的生物标志物，从而对患者进行癌症的早期诊断和实时监测治疗效率。
2、目前从全血中分离循环肿瘤细胞的主要技术包括密度梯度离心法、细胞过滤技术、细胞粘附技术、免疫磁珠分离技术、微流控芯片技术。其中，免疫磁珠分离技术因其易于操作、高捕获性能和快速分离而受到广泛关注。然而，血液中仅存在少量循环肿瘤细胞，却存在十亿个白细胞，免疫磁珠本身对蛋白、脂质等其他物质所具有的非特异性吸附会导致检测过程中其他生物标志物、血细胞等也被吸附上，检测灵敏度降低，造成假阴性结果，不利于下游分析。例如，尽管是已获得美国美国食品药品监督管理局批准的强生ctc检测系统，其白细胞背景仍然很高，导致纯度低于0.5％，存在的白细胞干扰下游分析。
3、因此，迫切需要开发能够与靶标细胞(如循环肿瘤细胞)特异性结合，同时减少与其他非靶标细胞(白细胞)的非特异性的新方法。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中的免疫磁性纳米
2、本专利技术的目的是提供所述制备方法得到的磁性基因工程化细胞。
3、本专利技术另一目的是提供所述磁性基因工程化细胞的应用。
4、本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
5、本专利技术保护一种磁性基因工程化细胞的制备方法，包括如下步骤：
6、s1.制备装载质粒的磁性纳米材料；
7、s2.向微流控芯片通入hek293细胞或其衍生细胞和步骤s1所得装载质粒的磁性纳米材料，制备摄取装载质粒的磁性纳米材料的细胞，所得即为磁性基因工程化细胞，所得即为磁性基因工程化细胞。
8、本专利技术采用微流控技术，通过微通道的挤压力和微流体作用力短暂破坏细胞膜使得装载质粒的磁性纳米材料大量进入，使细胞具有可携带自身和其他细胞磁迁移的强磁性，通过上述方法制备得到的磁性基因工程化细胞可特异性识别目标细胞并拖曳其分离，降低背景细胞的干扰。具体地，装有外源质粒的磁性基因工程化细胞表面能够表达特异性抗体，靶标蛋白具有高亲和力，使得在磁性迁移过程中细胞间的相互作用力大于磁场产生的拉力，磁性基因工程化细胞可和靶标细胞牢固结合；另外，微流控技术减少了细胞膜表面的磁性纳米材料，绝大部分材料被包裹在完整的天然生物膜中，完整的天然生物膜可降低与样本中的其他物质的非特异性吸附，降低背景物质的干扰。
9、进一步地，所述hek293(人胚胎肾细胞293)或其衍生细胞包括hek-293、hek-293t、hek-293a、hek-293ft中的一种或多种。
10、优选地，所述所述hek293或其衍生细胞为hek-293t。
11、进一步地，所述hek-293t细胞是hek293细胞的一种衍生物，通过将sv40大t抗原基因整合到hek293细胞的基因组中而得到。
12、进一步地，所述采用微流控芯片制备磁性基因工程化细胞的方法包括如下步骤：向微流控芯片通入单个细胞悬液，同时通入装载质粒的磁性纳米材料，收集从微流控芯片流出的细胞，培养至质粒表达，所得即为磁性基因工程化细胞；
13、其中，通入单个细胞悬液的速度大于通入装载质粒的磁性纳米材料的速度。其目的是为了尽可能提高细胞对磁性纳米材料的内吞量。
14、优选地，通入单个细胞悬液的速度为8～12μl/min。
15、优选地，所述通入装载质粒的磁性纳米材料的速度为2.5～7.5μl/min。
16、进一步地，所述培养至质粒表达后还包括后处理，所述后处理包括洗涤、孵育和重悬。后续的充分清洗进一步减少了细胞膜表面的磁性纳米材料，绝大部分材料被包裹在完整的天然生物膜中，完整的天然生物膜可降低与样本中的其他物质的非特异性吸附。
17、具体地，所述后处理包括将培养结束后的细胞充分洗涤后，加入消化液孵育，将孵育后的细胞重悬，即得磁性基因工程化细胞。
18、进一步地，所述充分冲洗为使用适量磷酸盐缓冲液于摇床上充分洗涤3～5次，以充分去除未被内化的磁性纳米材料。
19、进一步地，所述消化液为含消化酶的消化液，所述消化酶优选为胰酶。
20、进一步地，所述孵育的条件为于35～38℃孵育3～10分钟。
21、进一步地，单个细胞悬液指细胞在悬液中呈单个分散状态，而不是聚集成团或形成细胞簇。
22、进一步地，所述单个细胞悬液形成过程如下：将经消化的细胞加入缓冲溶液重悬即得。
23、进一步地，所述消化为使用消化酶(优选为胰酶)来分解或削弱细胞与培养底物(如培养瓶、培养皿的表面)之间的连接，使细胞从培养底物上分离下来，形成单个细胞悬液。
24、进一步地，所述培养的条件为35～38℃、3～7％ co2条件下培养24～36小时。
25、进一步地，所述单个细胞悬液的细胞密度为(0.1～10)×105个细胞/ml。
26、具体地，所述采用微流控芯片制备磁性基因工程化细胞的方法包括如下步骤：将消化后的细胞用磷酸盐缓冲液重悬至密度为每毫升1×105个细胞的单个细胞悬液，以8～12μl/min的流速向微流控芯片中通入单个细胞悬液，同时以2.5～7.5μl/min的流速向微流控芯片中通入装载质粒的磁性纳米材料，将处理后的细胞收集至装有培养基的培养皿中，于37℃、5％ co2条件下培养24-36小时，所得细胞即为磁性基因工程化细胞。
27、更进一步地，所述微流控芯片为pdms微流控芯片。
28、作为一种可选的实施方式，所述pdms微流控芯片包括如下步骤制备得到：首先，将pdms与交联剂按比例混合均匀后，倾倒于微流控芯片模具中，将填充有pdms的微流控芯片模具置于真空或加热条件下进行固化处理；固化完成后，从模具中剥离出pdms基片，并在其上或与其配合的另一基片上形成必要的进样孔和出样孔；最后，通过等离子体处理和热压键合实现封接(使pdms基片与其他基片的接触面实现可逆或不可逆键合)，从而形成pdms微流控芯片。
29、上述制备的pdms微流控芯片具有微通道结构。
30、进一步地，所述pdms与交联剂的质量比为(8～12)：1。
31、进一步地，所述pdms与交联剂按比例混合均匀后还可以进行去除气泡处理，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种磁性基因工程化细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述HEK293细胞或其衍生细胞包括HEK-293、HEK-293T、HEK-293A、HEK-293FT中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述采用微流控芯片制备磁性基因工程化细胞的方法具体包括如下步骤：向微流控芯片通入单个细胞悬液，同时通入装载质粒的磁性纳米材料，收集从微流控芯片流出的细胞，培养至质粒表达，所得即为磁性基因工程化细胞；
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述装载质粒的磁性纳米材料包括如下步骤制备得到：将磁性纳米材料和质粒共同孵育，获得装载质粒的磁性纳米材料。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述磁性纳米材料和质粒的质量比为(2～10):1。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述磁性纳米材料为正电性聚合物修饰的四氧化三铁纳米颗粒。
7.根据权利要求1～6任一所述制备方法，其特征在于，所述质粒表达的产物通过抗体-抗原作用与靶标
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述质粒表达的产物为抗上皮细胞黏附分子单链抗体。
9.权利要求1～8任一所述制备方法制备得到的磁性基因工程化细胞。
10.权利要求9所述磁性基因工程化细胞在制备检测和/或分选靶标细胞产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种磁性基因工程化细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述hek293细胞或其衍生细胞包括hek-293、hek-293t、hek-293a、hek-293ft中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述采用微流控芯片制备磁性基因工程化细胞的方法具体包括如下步骤：向微流控芯片通入单个细胞悬液，同时通入装载质粒的磁性纳米材料，收集从微流控芯片流出的细胞，培养至质粒表达，所得即为磁性基因工程化细胞；
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述装载质粒的磁性纳米材料包括如下步骤制备得到：将磁性纳米材料和质粒共同孵育，获得装载...
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