一种RNA反义纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种RNA反义纯化方法。所述方法包含以下步骤：S1、细胞的交联、裂解及基因组DNA的消化，得到RNA样品；S2、探针组溶液的制备；S3、磁珠预处理；S4、探针组‑磁珠复合物的制备；S5、反义纯化；S6、RNA的洗脱；S7、RNA的纯化。本发明专利技术通过预先使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭磁珠，降低了磁珠的非特异性吸附。本发明专利技术中磁珠首先与探针孵育，去除多余探针后再与RNA孵育，过量探针封闭链霉亲和素与蛋白质、核酸等的非特异性结合，提高检测特异性，灵敏度高；杂交后经梯度温度多次洗涤，保证磁珠充分结合探针并结合目标RNA，提高杂交效率。

【技术实现步骤摘要】
一种RNA反义纯化方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种RNA反义纯化方法。
技术介绍
长链非编码RNA(Longnon-codingRNA，lncRNA)是长达两百个核苷酸以上的转录本，绝大多数位于细胞核内。虽然lncRNA没有编码任何蛋白质，但它们在不同组织和发育阶段的表达依然具有特异性，这说明lncRNA具有重要的生物学意义。在测序技术的帮助下，人们已经发现了数千种lncRNA，但这些lncRNA的生物学功能依然还是个谜。2013年，JesseM.Engreitz教授开发了RNA反义纯化(RNAantisensePurification，RAP)技术，该技术可以在转录后水平鉴定RNA与RNA及相关DNA和蛋白质的互作。其原理如下：首先用紫外交联固定细胞，以维持如lncRNA等调控RNA与RNA、RBP的相互作用，然后进行细胞裂解，接着用生物素标记的寡核苷酸探针组与靶lncRNA杂交，基于生物素和链霉亲和素相互作用的原理，用链霉亲和素磁珠来分离、纯化探针-基因或蛋白质复合体，最后从纯化的复合体中分离蛋白质或RNA，以进行下游的分析。RAP技术被不同领域的研究者们广泛采用。如EngreitzJM等(2013)利用RAP技术通过研究LncRNAXist成功地阐释了Xist使X染色体失活的作用机理(EngreitzJM,PandyajonesA,McdonelP,etal.TheXistlncRNAexploitsthree-dimensionalgenomearchitecturetospreadacrosstheX-chromosome[J].Science,2013,341(6147):L35-L38.)。随着人们进一步认识非编码RNA在转录后水平发挥的重要作用，研究者对RAP技术进行不断的完善，旨在阐明lncRNA在机体内与内源性RNA、蛋白质的互作关系。2014年，EngreitzJM及其同事们运用RAP技术研究了核内小RNAU1和lncRNAMalat1与前体mRNA互作的作用机理。通过使用不同交联试剂及交联条件，改进的RAP技术能够进一步研究体内RNA-RNA互作关系及RNA在染色体上的定位及参与的转录调控(EngreitzJ,SirokmanK,McdonelP,etal.RNA-RNAInteractionsEnableSpecificTargetingofNoncodingRNAstoNascentPre-mRNAsandChromatinSites[J].Cell,2014,159(1):188-99.)。然而，现有RAP技术因磁珠会吸附非特异性的核酸及蛋白质、探针组与RNA杂交的效率不高、核酸及蛋白质等产品回收效率不高等问题而存在特异性低、灵敏度不佳的缺点。
技术实现思路
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种RNA反义纯化方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种RNA反义纯化方法，包含以下步骤：S1、细胞的交联、裂解及基因组DNA的消化，得到RNA样品；S2、探针组溶液的制备：将生物素标记的各探针溶解后混合，于85℃变性3min，快速转移冰浴，得到探针组溶液；S3、磁珠预处理：使用BSA(牛血清白蛋白)和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；S4、探针组-磁珠复合物的制备：将探针组溶液加入到预处理后的磁珠中，得到探针组-磁珠复合物；S5、反义纯化：向RNA样品中加入探针组-磁珠复合物，65℃变性10min，37℃、42℃和45℃各洗涤2次，每次洗涤5min，得到RNA-探针组-磁珠复合物；S6、RNA的洗脱：将RNA-探针组-磁珠复合物加入RNAElutionBuffer混匀，95℃加热2min，收集上清，向上清中加入ProteinaseKBuffer和ProteinaseK，温育消化得到洗脱后的RNA；S7、RNA的纯化：向洗脱后的RNA中加入等洗脱体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液混匀，离心收集上层水相，向水相中加入5MNaCl溶液、glycogen和无水乙醇，混匀后-80℃沉淀1～16h，离心弃上清，加入预冷的80％乙醇，离心弃上清，室温静置风干，加入无RNase水，65℃温育15min。优选地，步骤S1中取约1×108个细胞，去除培养基后用PBS洗涤一次，进行紫外交联，向交联后细胞中加入15ml预冷的PBS并短暂置于冰上，收集细胞，4℃400g离心3min收集细胞沉淀；向细胞沉淀中加入1.4ml预冷的LysisBuffer、5μlRNaseInhibitor，充分吹打裂解，抽动混匀3次，冰浴静置裂解10min，向裂解液中加入4.8μlDNaseSaltStock、15μlDNase，37℃温育10min；转移样品到冰浴环境，快速加入20μl0.5MEDTA、10μl0.5MEGTA、5μl1MDTT并充分混匀；加入等体积2×HybridizationBuffer，充分混匀后冰上静置10min；4℃16000g离心10min，转移上清至新无RNase离心管中，-80℃保存备用。优选地，步骤S2中每条探针用1×TES配制成100倍nmol的探针溶液，将所有探针溶液混合，取5μl混合液变性处理。优选地，步骤S3磁珠预处理的方法为：用1ml10mMTris-HClpH7.5重悬磁珠，颠倒混匀后磁力架上收集磁珠去上清，再重复洗涤2次；用1ml1×HybridizationBuffer重悬磁珠，颠倒混匀后磁力架上收集磁珠去上清；再向磁珠中加入1ml含BSA和寡核苷酸随机引物的1×TES，室温孵育30min后去除TES溶液。优选地，步骤S3中TES中BSA的浓度为0.05～0.5wt％，寡核苷酸随机引物的浓度为10～20μmol/L。优选地，步骤S3中寡核苷酸随机引物为20bp以内的DNA序列。优选地，步骤S4制备探针-磁珠复合物的方法为：将探针组溶液加入预处理后的磁珠中，并加入100μl2×TES，25℃温和旋转混合30min，磁力架上收集磁珠去上清；用0.35ml1×TES洗涤磁珠两次，去除TES。优选地，步骤S5中向RNA样品中加入探针组-磁珠复合物，65℃温育变性10min，用含0.5mMPMSF的WashBuffer37℃、42℃、45℃各洗涤2次，每次洗涤5min并磁力架上静置1min收集磁珠弃上清；用500μlWashBuffer悬浮磁珠，35℃摇动洗涤2～4min，磁力架上收集磁珠并去上清，并重复洗涤3～6次，得到RNA-探针组-磁珠复合物。优选地，步骤S6中向RNA-探针组-磁珠复合物中加入50μlRNAElutionBuffer充分混匀后，95℃加热2min，磁力架上收集磁珠并转移上清至新无RNase离心管中，重复上述步骤一次；再向上清中加入25μl5×ProteinaseKbuffer、1μgProteinaseK，50℃温育消化1h。优选地，步骤S7中RNA的纯化方法为：向洗脱后的RNA样品中加入等洗脱体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液，颠倒混匀15s；13000g4℃离心10min，收集上层水相，转移到新无RNA酶离心管中；向水相中加入20μl5MNaCl、2μlGlycogen、600μl无水乙醇，充分颠倒混匀后-80℃沉淀1～16本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RNA反义纯化方法，其特征在于，包含以下步骤：S1、细胞的交联、裂解及基因组DNA的消化，得到RNA样品；S2、探针组溶液的制备：将生物素标记的各探针溶解后混合，于85℃变性3min，快速转移冰浴，得到探针组溶液；S3、磁珠预处理：使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；S4、探针组‑磁珠复合物的制备：将探针组溶液加入到预处理后的磁珠中，得到探针组‑磁珠复合物；S5、反义纯化：向RNA样品中加入探针组‑磁珠复合物，65℃变性10min，37℃、42℃和45℃各洗涤2次，每次洗涤5min，得到RNA‑探针组‑磁珠复合物；S6、RNA的洗脱：将RNA‑探针组‑磁珠复合物加入RNA ElutionBuffer混匀，95℃加热2min，收集上清，向上清中加入Proteinase K Buffer和Proteinase K，温育消化得到洗脱后的RNA；S7、RNA的纯化：向洗脱后的RNA中加入等洗脱体积的苯酚‑氯仿‑异戊醇混合液混匀，离心收集上层水相，向水相中加入5M NaCl溶液、glycogen和无水乙醇，混匀后‑80℃沉淀1～16h，离心弃上清，加入预冷的80％乙醇，离心弃上清，室温静置风干，加入无RNase水，65℃温育15min。...

【技术特征摘要】
1.一种RNA反义纯化方法，其特征在于，包含以下步骤：S1、细胞的交联、裂解及基因组DNA的消化，得到RNA样品；S2、探针组溶液的制备：将生物素标记的各探针溶解后混合，于85℃变性3min，快速转移冰浴，得到探针组溶液；S3、磁珠预处理：使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；S4、探针组-磁珠复合物的制备：将探针组溶液加入到预处理后的磁珠中，得到探针组-磁珠复合物；S5、反义纯化：向RNA样品中加入探针组-磁珠复合物，65℃变性10min，37℃、42℃和45℃各洗涤2次，每次洗涤5min，得到RNA-探针组-磁珠复合物；S6、RNA的洗脱：将RNA-探针组-磁珠复合物加入RNAElutionBuffer混匀，95℃加热2min，收集上清，向上清中加入ProteinaseKBuffer和ProteinaseK，温育消化得到洗脱后的RNA；S7、RNA的纯化：向洗脱后的RNA中加入等洗脱体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液混匀，离心收集上层水相，向水相中加入5MNaCl溶液、glycogen和无水乙醇，混匀后-80℃沉淀1～16h，离心弃上清，加入预冷的80％乙醇，离心弃上清，室温静置风干，加入无RNase水，65℃温育15min。2.根据权利要求1所述的RNA反义纯化方法，其特征在于，步骤S1中取约1×108个细胞，去除培养基后用PBS洗涤一次，进行紫外交联，向交联后细胞中加入15ml预冷的PBS并短暂置于冰上，收集细胞，4℃400g离心3min收集细胞沉淀；向细胞沉淀中加入1.4ml预冷的LysisBuffer、5μlRNaseInhibitor，充分吹打裂解，抽动混匀3次，冰浴静置裂解10min，向裂解液中加入4.8μlDNaseSaltStock、15μlDNase，37℃温育10min；转移样品到冰浴环境，快速加入20μl0.5MEDTA、10μl0.5MEGTA、5μl1MDTT并充分混匀；加入等体积2×HybridizationBuffer，充分混匀后冰上静置10min；4℃16000g离心10min，转移上清至新无RNase离心管中，-80℃保存备用。3.根据权利要求1所述的RNA反义纯化方法，其特征在于，步骤S2中每条探针用1×TES配制成100倍nmol的探针溶液，将所有探针溶液混合，取5μl混合液变性处理。4.根据权利要求1所述的RNA反义纯化方法，其特征在于，步骤S3磁珠预处理的方法为：用1ml10mMTris-HClpH7.5重悬...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓香，董先辉，张娟，曾健，周剑，
申请(专利权)人：广州伯信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44