一种环状RNA表达载体及使用所述表达载体的TRAP方法技术

本发明专利技术提供了一种环状RNA表达载体及使用所述表达载体的适用于circRNA互作RNA或蛋白的TRAP方法，解决了传统的TRAP实验目前只应用LncRNA等互作RNA或蛋白研究的局限性问题。

【技术实现步骤摘要】
一种环状RNA表达载体及使用所述表达载体的TRAP方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种环状RNA表达载体及使用所述表达载体的适用于circRNA互作RNA或蛋白的TRAP方法。
技术介绍
环状RNA(CircularRNAs)是广泛且多样地存在于多种生物细胞中，具有调控基因表达作用的一类内源性ncRNA分子。最早于20世纪70年代在RNA病毒中被发现。之后几十年，人们在一些转录本中也发现了一些由外显子构成的circRNA，如结肠直肠癌缺失基因转录本、人类Ets-1基因转录本等，但当时它们被认为是转录的“噪音”，未引起人们太多的关注。而近年来，随着生物信息学技术的快速发展，Salzman等、Jeck等、Memczak等及Guo等分别在人类和小鼠的多种细胞中发现了成千上万种circRNA。近年来，随着高通量测序技术及基因芯片技术的高速发展，研究者们在真核生物体内发现了越来越多的circRNA。如Salzman等发现了数以百计的与人类基因表达相关的circRNA。Jeck等在人类成纤维细胞中检测到了高达25000多种circRNA。目前发现的circRNA，根据其在基因组中的来源及其构成序列的不同，可以分为3类：外显子来源的环形RNA分子，内含子来源的环形RNA分子和由外显子和内含子共同组成的环形RNA分子。CircRNA具有以下特征：表达水平差异较大；具有序列保守性；偏好于细胞浆中；不易被核酸外切酶RNaseR降解；外显子来源为主；属于ncRNA；可充当ceRNA的角色调控靶基因的表达；在转录或转录后水平发挥调控作用。这些特征使得circRNA在研究疾病发生机制、干预靶点和生物学标志物等方面显示显著优势。研究表明，circRNA在转录及转录后水平具有非常重要的基因表达调控作用。1、miRNA海绵作用：小脑变性相关蛋白1反义转录物(antisensetothecerebellardegeneration-relatedprotin1transcript，CDR1as)是一种circRNA，拥有至少60个与微小RNA-7(microRNA-7，miR-7)相结合的保守结合位点，从而充当miR-7海绵，有效影响miR-7靶基因活性。此外，研究发现，睾丸特异性基因Sry的circRNA具有16个微小RNA-138的靶位点，可与miR-138相互作用，充当miR-138海绵。2、调控基因转录：Zhang等鉴定出一种来源于基因内含子区域的circRNA，发现这种circRNA分子在细胞核内含量丰富，可参与基因转录调控。3、调控RNA结合蛋白：Bohjanen等设计了一种能够特异地结合反式激活调控蛋白(transactivatingregulatoryprotein，Tat)的circRNA分子，从而抑制I型人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)基因的表达。4、参与部分蛋白质翻译：丁型肝炎病毒(hepatitisDvirusantigen，HDAg)在疾病发展中起到重要的作用。另外，研究发现，人头骨瘤细胞U2OS中，circRNA具有翻译功能，尽管其翻译效率非常低。近年来，随着高通量测序技术及基因芯片技术的高速发展，研究者们在真核生物体内发现了越来越多的circRNA。如Salzman等发现了数以百计的与人类基因表达相关的circRNA。Jeck等在人类成纤维细胞中检测到了高达25000多种circRNA。Danan等又发现了生物体内circRNA的各种特性。同时，人们在认识circRNA的结构时候，发现它们在疾病的发生和发展中发挥了重要作用。如circRNA与肿瘤、神经系统疾病、动脉粥样硬化、糖尿病及病毒性肝炎等有关，因此，circRNA作为分子标记物的诊断价值在疾病的发现和治疗中发挥着巨大作用。然而，circRNA在生物体内发挥的功能及分子作用机制的研究却非常少。目前的研究中，仅仅明确了circRNA具有吸附miRNA的海绵作用、调控基因转录等作用。目前常用于研究circRNA与蛋白或RNA相互作用的方法RNA反义纯化(RNAantisensePurification，RAP)。RNA反义纯化(RNAantisensePurification,RAP)是一种用于研究转录后水平鉴定RNA与RNA、RNA与蛋白质互作机理的方法。RAP技术首先用紫外交联固定细胞，以维持如circRNA等调控RNA与RNA、RBP的相互作用，然后进行细胞裂解，接着用生物素标记的寡核苷酸探针(针对circRNA的接头序列)与靶circRNA杂交，基于生物素和链霉亲和素相互作用的原理，用链霉亲和素磁珠来分离、纯化探针-基因或蛋白质复合体，最后从纯化的复合体中分离蛋白质或RNA，以进行下游的分析。近年来，TRAP(taggedRNAaffinitypurification)技术也应用于研究RNA互作上，即使用特定的RNA标签分离表达的RNA的方法。最广泛使用的标签之一MS2，是存在于MS2复制酶mRNA的核糖体结合位点的19核苷酸长的病毒(噬菌体)RNA序列，其折叠成发夹环结构。通过MS2噬菌体衣壳RNA结合蛋白MS2(Kd为3-300×109，取决于茎环序列和MS2RBP变体)，以高特异性和亲和力识别该发夹环。作为含有肽标签的嵌合蛋白质的RBPMS2的表达促进了[MS2RNA/MS2蛋白]复合物与复合物中存在的其它分子的分离。MS2已被广泛用于标记在体外和体内转录其他应用的RNA。MS2下拉方法由三个基本步骤组成：①涉及构建两个质粒载体并将其共转染入哺乳动物细胞。第一个质粒表达含有感兴趣的测试RNA的嵌合RNA，然后是几个MS2RNA发夹(通常为12或24个串联MS2发夹环)。通常建议将MS2序列附着在测试RNA的3'末端，但在poly(A)尾部之前，以避免阻断翻译或可能翻译MS2序列。对照质粒简单地表达没有感兴趣的测试RNA的MS2发夹。第二质粒表达包含MS2衣壳蛋白和亲和标签的嵌合蛋白。与检测嵌合蛋白质相比，为了减少非特异性结合，表达更多的嵌合RNA是重要的。例如表达用MS2发夹环(lincRNA-p21-MS2)标记的小鼠lincRNA-p21作为感兴趣的RNA(MS2RNA在对照平行转染中表达)。②检测蛋白质MS2-GST涉及收获在转染质粒后24-48小时培养培养物，然后用保留天然RNP的完整性的缓冲液进行细胞裂解。然后将细胞裂解物与亲和试剂混合并使其结合，分离并洗涤RNP复合物。亲和试剂是附着于珠粒的谷胱甘肽-SH(GSH)GSH珠以高亲和力结合融合蛋白(MS2-GST)的GST组分，并可通过离心有效分离MS2RNP。然后用DNA酶处理回收的沉淀物，分离RNA进行进一步分析。③鉴定纯化的RNP复合物中存在的RNA或Protein。上述RAP方法具有3点较明显的缺点：(1)实验中使用到探针与circRNA杂交拉下circRNA，杂交温度较高，杂交效率较低且RNA易降解，容易造成实验结果的假阴性；(2)circRNA接头序列可能与蛋白结合，造成探针无法与circRNA结合，无法拉下circRNA，造成实验无法进行；(3)需要合成带有标记的RNA探针且探针易于降解。而传统的TRAP实验目前只应用LncRNA等互作RNA或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环状RNA表达载体，其特征在于，包含启动子‑反向互补反应上游元件‑内含子AG受体‑多克隆位点‑内含子GT供体‑反向互补反应下游元件‑终止子，所述内含子AG受体的序列如SEQ ID NO:1所示，所述内含子GT供体的序列如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种环状RNA表达载体，其特征在于，包含启动子-反向互补反应上游元件-内含子AG受体-多克隆位点-内含子GT供体-反向互补反应下游元件-终止子，所述内含子AG受体的序列如SEQIDNO:1所示，所述内含子GT供体的序列如SEQIDNO:2所示。2.根据权利要求1所述的环状RNA表达载体，其特征在于，所述反向互补反应上游元件的序列如SEQIDNO:3所示，所述反向互补反应下游元件的序列如SEQIDNO:4所示。3.根据权利要求1所述的环状RNA表达载体，其特征在于，所述启动子为pCMV启动子；所述终止子为BGHpA终止子。4.根据权利要求1所述的环状RNA表达载体，其特征在于，所述多克隆位点依此包含BamHI、填充序列和EcoRI。5.一种TRAP方法，其特征在于，所述TRAP方法使用权利要求1-4任一所述的环状RNA表达载体。6.根据权利要求5所述TRAP方法，其特征在于，所述的TRAP方法包含以下步骤：A、环状RNA表达载体的构建：得到PMS2-环状RNA表达载体；B、细胞培养、转染和裂解：准备细胞，使用步骤A得到的所述PMS2-环状RNA表达载体或PMS2空载转染细胞，培养后进行裂解，得到裂解液；C、取步骤B中的裂解液，进行Pulldown实验，得到NT2缓冲液，标记为TRAP液；D、取步骤C中的TRAP液，依此进行RNP收集和RNA纯化，并进行逆转录和qPCR检测。7.根据权利要求6所述TRAP方法，其特征在于，步骤B、细胞培养、转染和裂解的具体操作为：①准备细胞；②共同转染步骤A得到的所述PMS2-环状RNA表达载体或PMS2空载，和用150μLOPTIMEM稀释的1μgPMS2GST；③48小时后，用PBS洗涤细胞两次，并在lysisbuffer，蛋白酶抑制剂，RNase抑制剂和100mMDTT裂解液中裂解在冰上10分钟；④通过刮擦收集细胞裂解物后，在4℃下以10,000×g离心裂解物15分钟；⑤使用Bradford测定法收集上清液并测量蛋白质浓度；⑥使用2μg/μl裂解液进行pulldown实验。8.根据权利要求6所述TRAP方法，其特征在于，步骤C、Pulldown实验的具体操作为：①分别取200μL10％的GSH磁珠，用冰冷的PBS洗涤GSH磁珠两次，并用等体积的PBS重悬，制成50％浆液；②将上述磁珠分别加入两组上清液，4℃孵育3小时；③4℃，4,...

【专利技术属性】
技术研发人员：董先辉，王晓香，张娟，陈业兴，黄彩益，
申请(专利权)人：广州伯信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44