一种带有分子标志物的环状RNA及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种制备带有分子标志物的环状RNA的方法，其包括以下步骤：S1：将表达所述环状RNA的线性形式RNA的DNA构建体加入体外转录体系中，转录得到带有分子标志物并且5’末端为单磷酸基团的线性RNA；S2：将所述线性RNA加入连接体系，使所述线性RNA的5’端和3’端形成3’,5’‑磷酸二酯键，从而得到所述环状分子。本发明专利技术还涉及所述环状RNA在获得与细胞中所述环状RNA相互作用的蛋白质中的应用以及获得该蛋白质的方法。通过使用本发明专利技术的方法制备的环状RNA与原序列形成的环状RNA在结构上相似度极高，与蛋白的结合效力跟原序列所形成环状RNA基本没有差别，是研究与环状RNA相互作用的蛋白质的有力工具。

【技术实现步骤摘要】
一种带有分子标志物的环状RNA及其制备方法和应用
本专利技术涉及环状RNA领域，更特别地，涉及一种制备带有分子标志物的环状RNA的方法，该方法制备的带有分子标志物的环状RNA，所述环状RNA在获得与细胞中所述环状RNA相互作用的蛋白质中的应用以及获得该蛋白质的方法。
技术介绍
环状RNA(circularRNAs，circRNAs)是一类广泛存在于各种生物细胞中、具有调控基因表达功能的非编码RNA，具有结构稳定和组织特异性表达等特征。近年来，随着高通量测序技术的广泛应用，研究者们发现环状RNA具有保守性的特征。因此，这一类古老且的分子受到了极大的关注。2012年，Salzman团队发现几百种与人类基因表达密切相关的环状RNA；2013年，Jeck团队在人类成纤维细胞中检测到了约2.5万种环状RNA。相继有大量关于环状RNA分子研究的文献报道，其中，哈佛医学院Salmena团队提出了著名的“ceRNA分子调控假说”。该假说认为，ceRNA的生物学功能是通过microRNA应答元件(miRNAresponseelement，MRE)完成的，环状RNA分子可作为一种“分子海绵”，吸附大量microRNA，进而影响基因的转录调控。细胞内几乎所有分子都不是单独发挥作用的，需要结合相应的DNA、RNA或蛋白才能发挥正常的生物学功能。近年来，环状RNA分子与microRNA之间相互作用的研究越来越多，也越来越成熟，但是环状RNA与蛋白相互作用的研究却寥寥无几。究其原因，主要是目前尚缺乏大量获得带分子标记的环状RNA的分子生物学方法。本领域现有技术中，常常直接使用线性分子或通过在两端加接头形成环状分子来研究与环状RNA相互作用的蛋白质。然而，这样的分子在结构上与环状RNA的差异极大，因此，其得到的结果可信度非常低。也有些研究者公开了一些合成环状RNA的方法，但是，他们的方法往往需要进行复杂的化学处理步骤，从而降低了合成的可靠性，并推高了人工成本和试剂成本。因此，为了深入了解环状RNA分子，阐明其生物学功能，需要一种简单低廉的分子生物学方法来合成带分子标记的环状RNA。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供了一种制备带有分子标志物的环状RNA的方法，其包括以下步骤：S1：将表达所述环状RNA的线性形式RNA的DNA构建体加入体外转录体系中，转录得到带有分子标志物并且5’末端为单磷酸基团的线性RNA；S2：将所述线性RNA加入连接体系，使所述线性RNA的5’端和3’端形成3’,5’-磷酸二酯键，从而得到所述环状分子。优选地，所述体外转录体系中包含所述线性RNA的5’端第一个核糖核苷的单磷酸形式，以及所有四种核糖核苷的三磷酸形式，并且所述四种核糖核苷的三磷酸形式中的一种或多种被分子标志物标记，所述核糖核苷单磷酸的浓度高于其对应的核糖核苷三磷酸的浓度。优选地，所述核糖核苷单磷酸的浓度是其所对应的核糖核苷三磷酸浓度的5-15倍。优选地，所述分子标志物是生物素。优选地，所述连接体系中包含RNA连接酶和单链引导DNA，所述引导DNA的5’端与所述线性RNA的5’端互补，3’端与所述线性RNA的3’端互补，所述引导DNA的两端分别与所述线性RNA的5’端和3’端结合，并使所述线性RNA的5’端和3’端分别有0-10个碱基游离。优选地，所述引导DNA的5’端和3’端分别独立地为8-15nt长，所述引导DNA的3’端与5’端之间无间隔序列，或者有小于等于5nt的间隔序列。本专利技术还提供了上述方法制备的环状RNA。本专利技术还提供了所述环状RNA在获得与细胞中所述环状RNA相互作用的蛋白质中的应用。本专利技术还提供了一种获得与细胞中环状RNA相互作用的蛋白质的方法，其包括以下步骤：S3：将上述环状RNA作为探针，与细胞裂解液共同孵育，所述环状RNA跟与其相互作用的蛋白质形成环状RNA-蛋白复合物；S4：通过所述分子标志物捕获所述环状RNA-蛋白复合物；S5：从捕获的所述环状RNA-蛋白复合物分离得到所述蛋白质。优选地，所述分子标志物是生物素，并且通过磁珠捕获所述环状RNA-蛋白复合物。通过使用本专利技术的方法制备的环状RNA的序列仅在原序列的5’端多了少数几个多余的碱基，所形成的环状RNA与原序列形成的环状RNA在结构上相似度极高，与蛋白的结合效力跟原序列所形成环状RNA基本没有差别。所制备的环状RNA还带有分子标记，因此，是研究与环状RNA相互作用的蛋白质的有力工具。附图说明图1为研究环状RNA以及与其相互作用的蛋白质的流程图；图2为guideDNA与线性RNA的结合示意图；图3为RNA酶R消化处理后，将RNA在3％变性琼脂糖凝胶中电泳的电泳图；图4为RNA酶R处理的环状RNA探针经过逆转录PCR后，DNA产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳的电泳图；图5为环状RNA探针进行RNApull-down实验得到将蛋白洗脱之后在12％变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳后进行考马斯亮蓝染色得到的染色照片。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。本专利技术以环状RNA分子hsa_circ_0123777为例来进一步阐述本专利技术的内容，流程如图1所示。1.hsa_circ_0123777表达载体的构建在circularinteractome网站(http://circinteractome.nia.nih.gov)中找到环状RNA分子hsa_circ_0123777的编码序列(SEQIDNO:1)。以人类基因组DNA为模版扩增环状RNA分子的线性序列。为确保成功构建载体，设计引物时，在引物的5'端加入相应的限制性内切酶酶切位点。本例在前引物中加入HindIII(CCCAAGCTT)酶切位点，在后引物中加入BamHI(CGCGGATCC)酶切位点。扩增成功后用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收(DNA胶回收试剂盒购买自天根生化科技有限公司，货号为DP209)，DNA产物放至-20℃保存。如果无法成功扩增环状RNA分子的线性DNA序列，可以找相应的生物公司合成。将该环状RNA的线性序列连接到可用于体外转录的真核表达载体中，具体方法如下：选用的真核克隆载体为pcDNA3.1(+)-myc-HisC(可进行体外转录的真核载体均符合条件)。用内切酶HindIII和BamHI(购自TAKARA公司，HindIII货号为1060,BamHI货号为1010)分别对上述DNA产物和pcDNA3.1(+)-myc-HisC空载体进行双酶切，酶切体系如下：DNA产物酶切体系，总体积30μl：10xQuickCutGreenbuffer3μl，HindIII1.5μl，BamHI1.5μl，DNA产物2μg，余下为ddH2O；pcDNA3.1(+)-myc-HisC空载体双酶切体系，总体积20μl：10xQuickCutGreenbuffer2μl，BamHI1μl，HindIII1μl，pcDNA3.1(+)空载1μg，余下为ddH2O；充分混匀后，37℃，反应1.5小时，用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收(DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，货号为DP209)，回收结束后测样品浓度。将上述双酶切DNA产物连接至pc本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备带有分子标志物的环状RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将表达所述环状RNA的线性形式RNA的DNA构建体加入体外转录体系中，转录得到带有分子标志物并且5’末端为单磷酸基团的线性RNA；S2：将所述线性RNA加入连接体系，使所述线性RNA的5’端和3’端形成3’,5’‑磷酸二酯键，从而得到所述环状分子。

【技术特征摘要】
1.一种制备带有分子标志物的环状RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将表达所述环状RNA的线性形式RNA的DNA构建体加入体外转录体系中，转录得到带有分子标志物并且5’末端为单磷酸基团的线性RNA；S2：将所述线性RNA加入连接体系，使所述线性RNA的5’端和3’端形成3’,5’-磷酸二酯键，从而得到所述环状分子。2.根据权利要求1所述的制备带有分子标志物的环状RNA的方法，其特征在于，所述体外转录体系中包含所述线性RNA的5’端第一个核糖核苷的单磷酸形式，以及所有四种核糖核苷的三磷酸形式，并且所述四种核糖核苷的三磷酸形式中的一种或多种被分子标志物标记，所述核糖核苷单磷酸的浓度高于其对应的核糖核苷三磷酸的浓度。3.根据权利要求2所述的制备带有分子标志物的环状RNA的方法，其特征在于，所述核糖核苷单磷酸的浓度是其所对应的核糖核苷三磷酸浓度的5-15倍。4.根据权利要求1所述的制备带有分子标志物的环状RNA的方法，其特征在于，所述分子标志物是生物素。5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备带有分子标志物的环状RNA的方法，其特征在于，所述连接体系中包含RNA连接酶和单链引导DNA，所述引导DNA的5’端与所述线性RNA的5’...

【专利技术属性】
技术研发人员：童强松，郑丽端，杨枫，叶霖，李聃，宋华杰，陈亚俊，李欢欢，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42