本发明专利技术提供了一种利用CRISPR/Cas9提高猪产肉量的方法，包括通过CRISPR/Cas9技术构建含有靶向猪IGF2基因的sgRNA的打靶载体，转染猪细胞，制备含有编辑型IGF2基因的细胞，进行体细胞核移植和胚胎移植，其中，构建所述打靶载体所用的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术能够解除ZBED6对IGF2基因表达的抑制作用，上调IGF2的表达，提高猪瘦肉率和产肉量。
【技术实现步骤摘要】
一种利用CRISPR/Cas9提高猪产肉量的方法
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9提高猪产肉量的方法。
技术介绍
在中国地方猪遗传育种领域，通常采用传统瘦肉率选育方法，该技术的实施步骤为个体瘦肉率测定、BLUP估计育种值、综合排名选留个体。然而，传统瘦肉率选育需要大量的生长和屠宰性能测定，测定周期长，测定费用高，瘦肉率提高较为缓慢。这主要是因为传统育种主要考虑综合性状选育，不会以瘦肉率性状为单一性状进行选育；猪瘦肉率性状数据只能通过屠宰测定获得，而通常猪活体的瘦肉率只能通过背膘厚和眼肌面积数据估测；中国地方猪种本身就不具备高瘦肉率的种质遗传特性等原因所导致。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效提高猪(特别是两广小花猪)产肉量的方法。为了实现以上目的，本专利技术提供了一种利用CRISPR/Cas9提高猪产肉量的方法，包括通过CRISPR/Cas9技术构建含有靶向猪IGF2基因的sgRNA的打靶载体，转染猪细胞(优选成纤维细胞)，制备含有编辑型IGF2基因的细胞，进行体细胞核移植和胚胎移植，其中，构建所述打靶载体所用的sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了用于猪IGF2基因打靶的sgRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。此外，本专利技术还提供了靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体，其包括pX330载体以及连接在所述pX330载体上的靶向猪IGF2基因的sgRNA，所述靶向猪IGF2基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述猪包括但不限于两广小花猪。本专利技术还提供了一种宿主细胞，其包括上述靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体。本专利技术还提供了靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体的构建方法，其包括以下步骤：(1)设计并合成靶向猪IGF2基因的2条sgRNA，所述靶向猪IGF2基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)对所述靶向猪IGF2基因的sgRNA的正负两条寡核苷酸链进行磷酸化和程序性退火处理，使之形成具有BbsⅠ相应的黏性末端的双链DNA短片段；(3)使用BbsⅠ酶切pX330载体，线性化的质粒经电泳后，通过胶回试剂盒进行回收；(4)使用T4连接酶将步骤(2)得到的双链DNA短片段与步骤(3)得到线性化的pX330载体进行连接，得到靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体。在该构建方法中，优选地，所述猪包括但不限于两广小花猪。本专利技术还提供了上述猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体用于提高猪产肉量的应用。本专利技术还提供了上述猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体在制备用于提高猪产肉量的试剂方面的应用。本专利技术利用CRISPR/Cas9技术对两广小花猪的IGF2基因内含子3的ZBED6结合基序进行基因编辑，成功删除了IGF2基因内含子3的ZBED6结合基序GCTCG，证明破坏结合基序后，能够解除ZBED6对IGF2基因表达的抑制作用，上调IGF2的表达，结果表明，IGF2的上调表达能促进细胞的成肌分化潜能，并在一定程度上促进细胞的增殖，进一步将上述方法制备的含有编辑型IGF2基因的中靶细胞群通过体细胞核移植技术可获得高产肉量两广小花猪。本专利技术模拟自然突变，在基因组中不引入任何其他的外源DNA序列，可以有效避免转基因技术的生物安全风险，使本地猪种保持基因组的“纯度”，在最大限度地保留中国地方种猪优质肉质等优良性状的基础上，又能克服其产肉量低的劣势，特异性地提高其瘦肉率，大幅度提高优质猪肉生产和产量，对于改良和利用本地猪种资源具有重要的育种意义。附图说明图1是RGS报告载体构建示意图。图2是流式细胞分选红绿双荧光细胞过程示意图。图3是IGF2-sgRNA1打靶活性的验证结果。图4是编辑IGF2后的定量PCR结果。图5是IGF2基因编辑猪的鉴定结果。图6是IGF2基因编辑猪与同日龄野生型两广小花猪体型比较结果。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的应用范围。如未特别指出，实施例中涉及但未详细描述细节参数的操作为本领域技术人员所熟知的。实施例1、IGF2基因靶位点选择根据IGF2基因序列以及sgRNA基本设计原则(序列符合5＇-GN19NGG-3＇)，并借助软件分析(http://crispr.mit.edu/)，设计1条靶向猪IGF2基因的sgRNA。具体序列见表1。表1靶向IGF2基因gRNA序列信息注：PAM(protospacer-adjacentmotif)指sgRNA结合基序2、猪IGF2基因sgRNA/Cas9打靶载体构建pX330载体可同时表达sgRNA和密码子经人源性优化的Cas9蛋白。根据以上设计的2条sgRNA，合成相应的寡核苷酸正负单链，每条单链上添加有相应的BbsI黏性末端。用BbsI酶切1μgpX330载体，线性化的质粒经电泳后，通过胶回试剂盒回收酶切载体。同时，对正负两条寡核苷酸链进行退火和磷酸化处理，使之形成具有黏性末端的双链DNA短片段。将上述短片段和线性化的pX330载体通过T4连接酶进行连接反应，接着转化至DH5α感受态细胞中。最后挑选细菌单克隆，通过测序鉴定sgRNA表达载体是否构建成功。3、两广小花猪胎儿成纤维细胞培养与转染两广小花猪胎儿成纤维细胞从广东小耳花猪胎儿中分离建立。胎儿成纤维细胞在含有20％胎牛血清的DMEM培养基中生长。胎儿成纤维细胞生长至80％左右的汇合度时，先用PBS洗涤两遍，然后用胰酶消化2min，随后加入血清终止消化，将消化后的细胞收集至15mL的离心管进行离心，弃上清后再用PBS洗涤一遍进行第二次离心。离心后弃上清，然后用适量BufferR溶液重悬细胞，使细胞密度达到1.0×107cells/mL，使用NeonTM转染系统对胎儿成纤维细胞进行电击转染。转染条件为：voltage：1600V，width：10s，pulsenumber:3。细胞转染后24h更换培养基，在5％的CO2、37℃条件下进行培养。2d后进行流式分析、分选或者收取细胞提取DNA进行后续实验。4、T7E1实验T7E1酶(T7核酸内切酶I)可以用来检测CRISPR/Cas9介导的基因突变，通过PCR扩增出包含CRISPR/Cas9识别位点的IGF2基因片段，采用PCR清洁试剂盒纯化PCR产物。纯化后的PCR产物先在高温下变性，然后经逐步降温退火形成异源双链DNA，使用T7EI对上述产物进行酶切，设计合适的T7E1酶切引物(见表2)，使突变检测位点位于PCR片段的不对称点上，酶切后根据条带大小不同可以在聚丙烯酰胺胶中分辨出来，通过ImageJ软件计算CRISPR/Cas9的切割效率，估算其活性。使用T7E1进行酶切，设计合适的引物如表2所示。表2T7E1酶切引物引物序列IGF2-FCTTTAAGGAACCAGGTTTTCGCAGCIGF2-RGTGCTTTGAGGTCTCTGGAAGTTAG5、测序分析利用LATaq酶扩增出包含sgRNA所识别位点的IGF2基因片段，利用琼脂糖凝胶电泳分离该片段，然后用胶回试剂盒回收片段，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用CRISPR/Cas9提高猪产肉量的方法，包括通过CRISPR/Cas9技术构建含有靶向猪IGF2基因的sgRNA的打靶载体，转染猪细胞(优选成纤维细胞)，制备含有编辑型IGF2基因的细胞，进行体细胞核移植和胚胎移植，其特征在于，构建所述打靶载体所用的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种利用CRISPR/Cas9提高猪产肉量的方法，包括通过CRISPR/Cas9技术构建含有靶向猪IGF2基因的sgRNA的打靶载体，转染猪细胞(优选成纤维细胞)，制备含有编辑型IGF2基因的细胞，进行体细胞核移植和胚胎移植，其特征在于，构建所述打靶载体所用的sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述猪为两广小花猪。3.用于猪IGF2基因打靶的sgRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.一种靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体，其包括pX330载体以及连接在所述pX330载体上的靶向猪IGF2基因的sgRNA，所述靶向猪IGF2基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。5.一种宿主细胞，其包括权利要求4所述的靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体。6.一种靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载...
【专利技术属性】
技术研发人员：何祖勇，陈瑶生，刘小红，刘小凤，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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