一种癫痫动物模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种癫痫动物模型的构建方法，属于动物模型构建技术领域。该方法将FGF9

【技术实现步骤摘要】
一种癫痫动物模型的构建方法
本专利技术涉及一种动物模型构建方法，更具体地，涉及一种癫痫动物模型的构建方法，属于动物模型构建

技术介绍
癫痫(epliepsy)是一组由于脑部神经元异常过度放电所引起的突然、短暂、反复发作的中枢神经系统(Centralnervoussystem，CNS)功能失常的慢性疾病和综合征，是最常见的严重的神经系统疾病之一。据世界卫生组织估计，全球大约有7千多万癫痫患者，约占了世界人口的1％。我国癫痫的患病率在4％到7％之间，约有600万左右的活动性癫痫患者，同时每年有40万左右新发癫痫患者。癫痫可严重降低患者生活质量、加重患者家庭及社会经济负担，死亡危险性为一般人群的2-3倍，已经成为重要的社会问题。但是，癫痫的发病机制极其复杂，迄今为止尚未完全阐明。因此，研究癫痫发病机制以及开发新的治疗药物迫在眉睫。建立良好的动物模型是研究疾病的基础。目前，癫痫动物模型主要分为点燃模型和基因敲除模型。点燃模型(kindlingmodel)是通过重复给予一个阈下电或化学刺激引起部分或全面性癫痫发作的模型。电刺激过程十分复杂，且所埋置电极的一端暴露体外，长期保持在确切位置十分困难，因此成功率并不高。化学药物也能够引出点燃现象，比如利多卡因、戊四氮、印方以毒素和红藻氨酸等。化学药物点燃需要反复给与刺激，劳动强度太大，整个过程耗时耗力太长。此外，如果需要诱导出自发癫痫则需要过度点燃，需要的刺激量更大，小鼠死亡率较高，也缺乏一个可靠的标准。目前基因敲除和转基因技术已经在癫痫模型研究取得很大进展，成功制作了多个癫痫模型，例如cystatinB基因敲除模型、钾通道基因Kv1.1敲除模型、UBE3a基因敲除模型等，这些癫痫遗传学动物模型为遗传性癫痫的分子病理研究，以及为人类癫痫筛选候选基因提供了捷径。FGF9是一种成纤维细胞生长因子，具有神经胶原激活因子活性，参与了神经发育、细胞凋亡、胚胎发育和癌症进展等多项生理和病理过程。但是到现在为止，国内外未见FGF9与癫痫相关的报道。我们工作显示在GABA能神经元中敲除FGF9能够诱导小鼠癫痫。因此，研究FGF9条件敲除小鼠的癫痫机制，对阐明癫痫的作用机制以及寻找新的靶点提供依据具有非常重要的研究意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷提供一种癫痫动物模型的构建方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的。γ-氨基丁酸(gamma-Aminobutyricacid,GABA)是中枢神经系统内最具代表性的抑制性神经递质，在中枢神经系统广泛分布，主要作用是平衡谷氨酸递质的兴奋性活性。FGF9是一种分泌性的成纤维细胞生长因子，参与了神经发育、细胞凋亡、胚胎发育和癌症进展等多项生理和病理过程，对脑神经元有维持生存和促进生长及修复受损的作用。小鼠FGF9基因在14号染色体正链上，全长54.2kb，专利技术人通过研究发现GABA能神经元中条件性敲除FGF9基因(FGF9fl/flVGAT-cre)小鼠出现后肢阵挛，全身强直-阵挛性发作等一系列癫痫症状，部分小鼠死于癫痫持续状态。脑电图(EEG)显示FGF9fl/flVGAT-cre小鼠出现显著的癫痫波。于是，本专利技术在上述研究的基础上，提供GABA能神经元中条件性敲除FGF9基因的方法以及在构建癫痫动物模型中的应用。首先，所述GABA能神经元中条件性敲除FGF9基因的方法，即利用GABA能神经元特异性Cre小鼠与FGF9基因外显子1两侧携带LoxP的Floxallele小鼠(FGF9fl/fl)杂交，制备FGF9fl/flVGAT-cre小鼠(CKOVGAT)，从而实现在GABA能神经元中条件性敲除FGF9基因。该方法主要利用Cre/loxP重组酶系统。Cre重组酶是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。LoxP序列具有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，从而实现基因敲除。本专利技术所述FGF9fl/fl小鼠制备步骤如下：1)构建FGF9条件性敲除的打靶载体分析FGF9基因的结构，exon1(ENSMUSE00000337574)可被条件性敲除，敲除后FGF9基因不表达，在5’端和3’端loxP位点分别插入在启动子区和intron2的非保守区；2)ES细胞电转和正确重组的ES细胞克隆筛选打靶载体线性化后(序列边缘限制性内切酶酶切打靶载体)，进行2次电转ES细胞，共挑选出600个克隆，经PCR和Southernblot筛选，共筛选到10个两端均正确重组的ES细胞克隆；3)ES细胞显微注射囊胚及子宫移植挑选5只小鼠，共注射3批ES细胞克隆，共出生小鼠51只，其中克隆4-A6(2#)产生第一只阳性F1小鼠，基因型鉴定为阳性杂合小鼠，将杂合子小鼠与Flp-deleter小鼠交配，得到带有Flp转基因的floxed(fl)杂合子小鼠，即FGF9fl/+小鼠，FGF9fl/+小鼠互相交配得到FGF9fl/fl纯合小鼠。其次，本专利技术提供GABA能神经元中条件性敲除FGF9基因在癫痫动物模型构建中的应用，即一种癫痫动物模型的构建方法。一种癫痫动物模型的构建方法，包括如下步骤：将FGF9fl/fl小鼠与GABA能神经元Cre小鼠交配，获得FGF9fl/+VGAT-Cre杂合敲除小鼠，之后再与FGF9fl/fl纯合小鼠交配，获得FGF9纯合敲除小鼠(FGF9fl/flVGAT-Cre)，即癫痫动物模型。以同窝FGF9fl/fl小鼠为对照小鼠，维持小鼠C57BL/6背景。C57BL/6背景常被认作"标准"的近交系，是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学研究中常用的品系。通过PCR对小鼠进行基因型鉴定，检测FGF9小鼠的LoxP位点，westblot验证脑组织中FGF9蛋白表达降低。本专利技术首次在GABA能神经元中条件性敲除FGF9基因，并通过GABA能神经元中条件性敲除FGF9基因构建癫痫动物模型，目前在国内外未见相关报道；该方法构建小鼠模型具有以下优点：(1)构建得到的FGF9fl/flVGAT-Cre癫痫动物模型稳定，癫痫发作重复率高达100％；(2)该癫痫动物模型不仅癫痫症状比较典型(如小鼠出现包括点头、抽搐、后肢阵挛、全身强直-全身强直阵挛发作而跌倒、癫痫持续状态等癫痫症状)，而且脑电图也显示典型的癫痫波(重复高振幅持续10s以上的棘波)；(3)构建得到的癫痫动物模型小鼠生存周期长，除早期部分死于癫痫持续状态，其余小鼠生存可达24个月；(4)构建得到的癫痫动物模型主要由于GABA/Glu递质失衡造成，与临床上认为神经递质失衡是癫痫发作的主要原因一致，利用本专利技术所述癫痫动物模型可以进一步完善癫痫发病机制以及寻找筛选抗癫痫药物。总之，该GABA能神经元中条件性敲除FGF9基因癫痫动物模型更贴近临床癫痫症状及机制，为临床癫痫病因学的研究，以及进一步的诊断和治疗提供了良好的研究工具。附图说明图1为利用Cre/loxP重组酶系统建立FGF9条件敲除动物模型的示意图。图2为FGF9fl/flVGAT-C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.GABA能神经元中条件性敲除FGF9基因的方法，其利用GABA能神经元特异性Cre小鼠与FGF9基因外显子1两侧携带LoxP的Flox allele小鼠(FGF9fl/fl)杂交，得到FGF9fl/flVGAT‑cre小鼠，实现在GABA能神经元中条件性敲除FGF9基因。

【技术特征摘要】
1.GABA能神经元中条件性敲除FGF9基因的方法，其利用GABA能神经元特异性Cre小鼠与FGF9基因外显子1两侧携带LoxP的Floxallele小鼠(FGF9fl/fl)杂交，得到FGF9fl/flVGAT-cre小鼠，实现在GABA能神经元中条件性敲除FGF9基因。2.根据权利要求1所述的GABA能神经元中条件性敲除FGF9基因的方法，其特征在于，所述FGF9fl/fl小鼠制备步骤如下：1)构建FGF9条件性敲除的打靶载体分析FGF9基因的结构，exon1(ENSMUSE00000337574)可被条件性敲除，敲除后FGF9基因不表达，在5’端和3’端loxP位点分别插入在启动子区和intron2的非保守区；2)ES细胞电转和正确重组的ES细胞克隆筛选打靶载体被序列边缘限制性内切酶酶切从而线性化，进行2次电转ES细胞，挑选出600个克隆，经PCR和Southernblot筛选，筛选到10个两端均正确重组的ES细胞克隆；3)ES细胞显微...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春岩，郭默然，段伟松，伊乐，李忠尧，刘亚坤，毕悦，李媛媛，张杰，
申请(专利权)人：河北医科大学第二医院，
类型：发明
国别省市：河北,13