一种带有黄色或红色荧光蛋白标签的非洲爪蟾卵母细胞表达载体及应用制造技术

本发明专利技术公开了带有黄色或红色荧光标签的可用于非洲爪蟾卵母细胞表达的载体及应用，通过分子生物学手段对pGH19质粒进行改造，具体开发成含有增强型黄色或单体红色荧光蛋白标签且适合非洲爪蟾卵母细胞表达的载体pGH19‑EYFP或pGH19‑mRFP。本发明专利技术所述载体既可正常表达目的基因，又可通过荧光显微镜或共聚焦显微镜检测带有黄色或红色荧光标签的靶蛋白的分布情况和表达模式，为非洲爪蟾卵母细胞表达的蛋白情况提供更直观简洁的检测方式；可实时观察蛋白表达的时空动态；对于目的蛋白后期的提取、纯化、鉴定和功能性分析，仅需使用通用型抗体即可检测到靶标蛋白的表达情况，大大简化了实验流程，节省了实验时间和经济成本。

【技术实现步骤摘要】
一种带有黄色或红色荧光蛋白标签的非洲爪蟾卵母细胞表达载体及应用
本专利技术涉及分子生物学及基因工程领域。具体来说，涉及带有黄色或红色荧光标签的非洲爪蟾卵母细胞表达载体及应用。
技术介绍
非洲爪蟾卵母细胞是一种功能强大、适用范围广的异源性表达体系，被广泛应用于外源性钙离子通道、氯离子通道、钾离子通道、钠离子通道、γ-氨基丁酸受体、谷氨酸受体、乙酰胆碱受体等异源蛋白的表达及其生理学和药理学特性的研究。它在探讨化合物的作用机制、评价和筛选靶标化合物的药效和安全性等方面发挥着重要作用，是生物学、医药学、神经学、农药学等领域研究中不可或缺的异源型表达系统。黄色和红色荧光蛋白是指能在绿色光(500-565nm)激发下会发出黄色和红色荧光的蛋白质，已经作为新型报告基因在生物学的许多研究领域中得到应用。黄色荧光蛋白的突变体—增强型黄色荧光蛋白(EnhancedYellowFluorescentProtein，EYFP)和单体红色荧光蛋白(MonomericRedFluorescentProtein，mRFP)因其发光稳定、亮度和区分度高，因此被广泛应用于基因表达、细胞分化及蛋白质的体内定位和转运等研究。pGH19质粒是一种含有多种限制性内切酶位点且应用广泛的蛋白质表达载体，因其启动子和终止子附近分别含有非洲爪蟾β-球珠蛋白的5’UTR和3’UTR碱基序列，能够在非洲爪蟾卵母细胞中成功地表达异源性蛋白质，所以被广泛应用于非洲爪蟾卵母细胞的异源表达研究。利用pGH19质粒在非洲爪蟾卵母细胞中表达的蛋白质可通过电生理实验检测其生理学和药理学特性，但是不能在显微镜下观察目标蛋白表达与否及时空表达动态，无法进行有效的亚细胞定位和目的蛋白的纯化及鉴定，而针对目的蛋白特异性抗体的获取也需要消耗大量的时间和经济成本。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供带有黄色或红色荧光蛋白标签的非洲爪蟾卵母细胞表达载体，该载体既可以在非洲爪蟾卵母细胞中成功表达有活性的目的蛋白，又带有可直接镜检的黄色或红色荧光，能够对蛋白的表达进行实时监测和亚细胞定位，并可利用通用型抗体anti-EYFP和mRFP对表达蛋白进行纯化和检测不同亚基的结合模式，从而免去制备特异性抗体的时间和经济成本。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：带有黄色或红色荧光蛋白标签的非洲爪蟾卵母细胞表达载体，其特征在于该载体为带有修饰序列的EYFP或带有修饰序列的mRFP基因连接到pGH19质粒上获得；带有修饰序列的EYFP或带有修饰序列的mRFP基因具体为EYFP基因或mRFP基因的5’端加入限制性内切酶A的识别碱基序列和一段人工设计的酶切位点碱基序列，及3’端自身携带的限制性内切酶B的识别碱基序列。所述人工设计的酶切位点碱基序列如SEQIDNO.3所示，通过添加该序列的酶切位点，可以解决pGH19质粒插入EYFP和mRFP基因后无法插入目的基因的问题，且可以确保成功插入目的基因后，不会破坏EYFP和mRFP基因活性和pGH19质粒原有功能，即在保障pGH19质粒原有功能的前提下，又可使目的蛋白带有黄色或红色荧光标签。本专利技术所述限制性内切酶A可以为EcoRI限制性内切酶、XmaI限制性内切酶、SmaI限制性内切酶、BamHI限制性内切酶、BstBI限制性内切酶、XhoI限制性内切酶或EcoRV限制性内切酶。本专利技术所述限制性内切酶A的碱基识别序列可以为EcoRI限制性内切酶碱基识别序列(GAATTC，如SEQIDNO.4所示)、XmaI限制性内切酶碱基识别序列(CCCGGG，如SEQIDNO.5所示)、SmaI限制性内切酶碱基识别序列(CCCGGG，如SEQIDNO.6所示)、BamHI限制性内切酶碱基识别序列(GGATCC，如SEQIDNO.7所示)、BstBI限制性内切酶碱基识别序列(TTCGAA，如SEQIDNO.8所示)、XhoI限制性内切酶碱基识别序列(CTCGAG，如SEQIDNO.9所示)或EcoRV限制性内切酶碱基识别序列(GATATC，如SEQIDNO.10所示)。本专利技术所述限制性内切酶B可以为XbaI限制性内切酶、BsrGI限制性内切酶、PspOMI限制性内切酶、ApaI限制性内切酶、BmgBI限制性内切酶或BstPI限制性内切酶。本专利技术所述限制性内切酶B的碱基识别序列可以为XbaI限制性内切酶碱基识别序列(TCTAGA，如SEQIDNO.11所示)、BsrGI限制性内切酶碱基识别序列(TGTACA，如SEQIDNO.12所示)、PspOMI限制性内切酶碱基识别序列(GGGCCC，如SEQIDNO.13所示)、ApaI限制性内切酶碱基识别序列(GGGCCC，如SEQIDNO.14所示)、BmgBI限制性内切酶碱基识别序列(CACGTC，如SEQIDNO.15所示)或BstPI限制性内切酶碱基识别序列(GGTNACC，如SEQIDNO.16所示)。具体的，本专利技术提供带有黄色荧光标签的非洲爪蟾卵母细胞表达载体pGH19-EYFP，该载体的碱基序列如SEQIDNO.1所示。具体的，本专利技术还提供带有红色荧光标签的非洲爪蟾卵母细胞表达载体pGH19-mRFP，该载体的碱基序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供本专利技术所述载体在生物检测中的应用，特别是在实时观察蛋白表达动态或蛋白纯化或检测中的应用。本专利技术还提供本专利技术所述载体中插入目的基因形成的基因表达载体。本专利技术还提供本专利技术所述基因表达载体在生物检测中的应用，特别是在实时观察蛋白表达动态或蛋白纯化或检测中的应用。本专利技术还提供一种SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示序列的载体pGH19-EYFP和pGH19-mRFP的构建方法为：1)从NCBI网站下载EYFP和mRFP碱基序列，并设计引物，对正向引物和反向引物进行修饰，分别在它们的5’端加入内切酶EcoRI和XbaI的酶切位点和保护性碱基，并在正向引物的5’端EcoRI酶切位点后加入一段人工设计的酶切位点碱基序列。引物序列为：ForwardPrimer(5’-3’):aagGAATTCGAAGCTTCTCGAGATATCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC，ReversePrimer(5’-3’):ttgTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG.其中，小写字母代表保护性碱基，斜体字母代表EcoRI和XbaI限制性内切酶识别碱基序列，下划线字母代表人工设计插入的酶切位点碱基序列。2)通过PCR扩增和DNA回收操作，得到带有修饰序列的EYFP或mRFP基因产物；3)对pGH19质粒进行限制性内切酶EcoRI和XbaI的双酶切。将酶切后的质粒及带有修饰序列的EYFP或mRFP基因通过T4连接酶进行连接，即得到带有黄色或红色荧光标签的非洲爪蟾卵母细胞表达载体—pGH19-EYFP或pGH19-mRFP。本专利技术中，步骤3)中的EcoRI限制性内切酶可由XmaI限制性内切酶、SmaI限制性内切酶、BamHI限制性内切酶、BstBI限制性内切酶、XhoI限制性内切酶、EcoRV限制性内切酶或含有上述酶切位点的任意限制性内切酶替换。本专利技术步骤3)中的XbaI限制性内切酶可由BsrGI限制性内切酶、PspOMI限制性内切酶、ApaI限制性内切酶、Bmg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.带有黄色或红色荧光蛋白标签的非洲爪蟾卵母细胞表达载体，其特征在于该载体为带有修饰序列的EYFP或带有修饰序列的mRFP基因连接到pGH19质粒上获得；带有修饰序列的EYFP或带有修饰序列的mRFP基因具体为EYFP基因或mRFP基因的5’端加入限制性内切酶A的识别碱基序列和一段人工设计的酶切位点碱基序列，及3’端自身携带的限制性内切酶B的识别碱基序列。

【技术特征摘要】
1.带有黄色或红色荧光蛋白标签的非洲爪蟾卵母细胞表达载体，其特征在于该载体为带有修饰序列的EYFP或带有修饰序列的mRFP基因连接到pGH19质粒上获得；带有修饰序列的EYFP或带有修饰序列的mRFP基因具体为EYFP基因或mRFP基因的5’端加入限制性内切酶A的识别碱基序列和一段人工设计的酶切位点碱基序列，及3’端自身携带的限制性内切酶B的识别碱基序列。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述人工设计的酶切位点碱基序列如SEQIDNO.3所示。3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述限制性内切酶A为EcoRI限制性内切酶、XmaI限制性内切酶、SmaI限制性内切酶、BamHI限制性内切酶、BstBI限制性内切酶、XhoI限制性内切酶或EcoRV限制性内切酶。4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述限制性内切酶A的碱基识别序列选自SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9或S...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵春青，盛成旺，贾忠强，黄秋堂，韩召军，刘泽文，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32