一种环状RNA及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种环状RNA及其用途，属于生物医药技术领域，所述环状RNA是由肝组织中SOX5基因经转录、剪切、环化而成的，所述环状RNA可应用于肝癌的诊断和治疗。本发明专利技术对环状RNA进行深入研究，以便于诊断和治疗肝癌。

【技术实现步骤摘要】
一种环状RNA及其用途
本专利技术属于生物医药
，尤其涉及一种环状RNA及其用途。
技术介绍
原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)简称肝癌，是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。全球每年约有74万患者被新诊断为肝细胞癌，同时约有69万患者死于肝癌。其中，我国占到了全球每年新发病例的55％，成为全世界肝癌最高发的地区之一。环状RNA(ciucularRNA，circRNA)是区别于传统线性RNA的RNA家族新成员，不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。最新研究表明circRNA具有闭合环状结构，主要通过非典型可变剪切加工产生，广泛存在于各种生物细胞中，具有结构稳定，难以被RNA酶降解、表达丰度高、物种间保守性好，表达具有组织及时空特异性等特征，这些特点使得circRNA在肝癌诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术不足，而提供一种环状RNA，且本专利技术还提供了该环状RNA的用途。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种环状RNA，所述环状RNA的circbaseID为has_circ_0098181。环状RNAhas_circ_0098181在基因组上的定位为：chr12：23998916-24048958，相应的线性基因为SOX5(NM_152989)，环化的核苷酸序列有443个碱基。目前尚未有任何关于环状RNAhsa_circ_0098181功能的报道。环状RNAhas_circ_0098181对应的cDNA序列如SEQIDNO:1所示，所述环状RNAhas_circ_0098181的序列如SEQIDNO:2所示。所述环状RNAhas_circ_0098181的结构是由如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列首尾连接成的环状结构。另外，本专利技术还提供一种诊断肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括检测所述环状RNA的表达量的试剂。本专利技术研究发现肝组织中SOX5基因的RNA存在环化现象，且环状RNAhas_circ_0098181在肝癌组织中表达显著下调。作为上述技术方案的改进，所述试剂包括扩增所述环状RNA的引物。作为上述技术方案进一步地改进，所述引物为由如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的DNA序列组成的引物对或由如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的DNA序列组成的引物对。作为上述技术方案的改进，所述试剂盒还包括肝组织RNA的提取试剂、cDNA的逆转录试剂。另外，本专利技术还提供一种治疗肝癌的药物组合物，所述药物组合物包括所述的环状RNA和增加所述环状RNA的表达量的试剂中的至少一种。本专利技术发现，过表达的环状RNAhas_circ_0098181引起细胞G1期阻滞，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖，抑制迁移和侵袭。另外，本专利技术还提供一种治疗肝癌的表达载体，所述表达载体表达所述的环状RNA。另外，本专利技术还提供所述的环状RNA在制备肝癌诊断试剂盒中的用途。另外，本专利技术还提供所述的环状RNA在制备或筛选治疗肝癌的药物中的用途。另外，本专利技术还提供增加所述环状RNA的表达量的试剂在制备治疗肝癌的药物中的用途。本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术首先通过设计特异的环状RNA引物进行RT-PCR、一代测序、RNA酶降解实验证实环状RNAhsa_circ_0098181的基因hsa_circ_0098181客观存在；(2)本专利技术通过检测肝癌病人中环状RNAhsa_circ_0098181表达情况，发现其表达水平明显降低，可作为肝癌的诊断标志；(3)本专利技术对hsa_circ_0098181基因进行了体外细胞功能学的研究，通过将hsa_circ_0098181基因构建到环状RNA专用的慢病毒载体上，以建立过表达该基因的稳定细胞株；过表达环状RNAhsa_circ_0098181的肝癌细胞株的增殖速度显著减慢，hsa_circ_0098181基因及其表达产物环状RNAhsa_circ_0098181可以应用在制备治疗肝癌的药物中。附图说明图1为本专利技术实施例1中hsa_circ_0098181基因表达产物的琼脂糖凝胶电泳图，并对PCR产物进行Sanger测序明确测到环化位点；图2反映本专利技术实施例2中RNaseR对环状RNAhsa_circ_0098181和GAPDHRNA的表达量的影响；图3为本专利技术实施例2中肝癌组织和癌旁组织的环状RNAhsa_circ_0098181表达量；图4为本专利技术实施例3中构建好的稳定细胞株97L-hsa_circ_0098181和LM3-hsa_circ_0098181的环状RNAhsa_circ_0098181表达量；图5为过表达的环状RNAhsa_circ_0098181对97L和LM3细胞功能的影响示意图；其中，图5A反映本专利技术实施例4中过表达的环状RNAhsa_circ_0098181引起肝癌细胞G1期阻滞，图5B反映本专利技术实施例5中过表达的环状RNAhsa_circ_0098181促进细胞凋亡，图5C反映本专利技术实施例6中过表达的环状RNAhsa_circ_0098181抑制细胞增殖，图5D反映本专利技术实施例7中过表达的环状RNAhsa_circ_0098181抑制细胞迁移，图5E反映本专利技术实施例8中过表达的环状RNAhsa_circ_0098181抑制细胞侵袭。具体实施方式为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本专利技术作进一步说明。实施例1：RT-PCR反应检测环状RNAhsa_circ_0098181在肝癌组织中的表达，具体实验方案如下：1.1RNA提取(1)组织处理：取10mg左右组织加入1mLTrizol，用匀浆机匀浆；离心15min，12000g，取上清；(2)向上清中加入200μL氯仿，上下用力颠倒混匀半分钟，静置3min；(3)4℃、12000g离心15min，此时可见裂解液分三层：上层为水相的RNA；中层为DNA、脂类等；下层为细胞残渣、蛋白、多糖等；(4)取上清到新的EP管内，加入等体积的异丙醇，混匀；静置10min后，4℃、12000g离心10min；(5)小心去掉上清，注意不要丢失RNA沉淀，加入1mL75％乙醇，上下颠倒，使沉淀块重悬起；(6)4℃、12000g离心10min，小心去掉上清，尽量吸干管壁的液体，注意不要丢失RNA沉淀，若沉淀松动可再次离心；晾干约15min，至管壁无液体；加入适量体积(20～30μL)的DEPC水溶解RNA，58℃水浴10min；(7)取出2μL定量，测量缓冲液为10mMTrisCl(pH7.8)，根据定量结果进行逆转录(1A260＝40μg/mL，A260/A280＝1.8～2.1)。1.2cDNA逆转录(1)实验体系M-MLVReverseTranscriptase：1.3引物环状RNA引物为反向引物，同时设计一对正向引物做对照，RT-PCR时设立一组gDNA模板对照，同时以线性基因GAPDH作为阴性对照；使用的引物如表1所列：表1为引物SEQIDNO:3hsa_circ_0098181_FdivergentGTGGGCGACAGAGTGGCGAGSEQIDNO:4hs本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环状RNA，其特征在于，所述环状RNA的circbase ID为has_circ_0098181。

【技术特征摘要】
1.一种环状RNA，其特征在于，所述环状RNA的circbaseID为has_circ_0098181。2.一种诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测如权利要求1所述环状RNA的表达量的试剂。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括扩增所述环状RNA的引物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物为由如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的DNA序列组成的引物对或由如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的DNA序列组成的引物对。5.根据权利要求2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡木炎，赖炳权，罗景燕，何重华，许少飞，李伟琴，
申请(专利权)人：中山大学附属肿瘤医院，广州永诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44