一种大豆高效启动子盐诱导功能元件及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种大豆高效启动子盐诱导功能元件，该元件命名为大豆高效启动子盐诱导功能元件GmBM1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术还公开了含所述盐诱导功能元件的植物双荧光报告载体pGmBM1‑pGreen II‑0800LUC，以及所述盐诱导功能元件在提高植株盐胁迫耐受性中的应用。实验证明，本发明专利技术所述盐诱导功能元件可快速高效的响应高盐诱导，预示其可广泛用于培育抗盐的植物品种及转基因耐盐作物的相关功能研究。

【技术实现步骤摘要】
一种大豆高效启动子盐诱导功能元件及其应用
本专利技术涉及一种盐诱导功能元件及应用，尤其涉及一种大豆的新型高效启动子盐诱导功能元件及其应用。
技术介绍
大豆(Glycinemax(L.)Merill)是一种传统的可食用豆科作物，也是公认的重要双子叶植物，种子为人类提供了丰富的蛋白、高质量的植物油、矿物质和维生素等资源。另外，大豆异黄酮、皂角苷、磷脂酰胆碱等也作为重要的功能化合物存在于大豆种子中。根据高盐胁迫下植物正常生长的比率对植物进行盐胁迫耐受性分级，分级结果显示栽培大豆是一种中度耐盐的农作物，土地高盐碱含量限制了大豆种植业的发展。高等植物自身生长发育和对环境变化的响应是通过调控目的基因的表达来实现的。而转录因子和基因顺式作用元件的相互作用，可以作为基因表达调控的分子开关。正是转录因子与抗逆功能基因启动子区域顺式作用元件的相互作用激活了抗逆相关基因的表达，提高了植物的综合抗逆性。利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在转基因植物中表达是培育抗逆作物新品种的有效方法。目前能应用于转基因研究的诱导型启动子元件仍然很少，对于新的抗逆相关启动子功能元件的发现、克隆、分析以及与顺式元件相互作用的转录因子的研究仍然是今后研究的重点，将功能明确的抗逆启动子功能元件成功应用到转基因植物中调控抗逆基因的表达是植物抗逆基因工程的研究方向。目前在植物中，研究较深入的有：脱落酸响应元件(ABA-responsiveelement,ABRE)、乙烯响应元件(ethylene-responsiveelement,ERE)、茉莉酸类物质应答元件(jasmonate-responsiveelement,JRE)、低温响应元件(low-tempraturereponsiveelement,LTRE)和干旱应答元件(dehydration-responsiveelement,DRE)等。植物盐胁迫相关启动子元件的研究，有助与了解盐胁迫下基因转录调控表达模式和其调控机制，有助得到耐盐的转基因植物。申请人实验室前期工作中已经证明来源于耐盐品种——圣豆9号的GmNAC4基因为盐响应基因，且对盐胁迫为正调节作用(专利CN102660554A)。研究大豆启动子盐诱导功能元件可以更好地帮助阐释耐盐大豆植株的盐胁迫应答分子机制，同时可为获得通用型的盐诱导型启动子功能元件提供重要参考，可用于转基因耐盐作物的培育。经过检索，未见有关于该盐诱导启动子功能元件的相关报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种大豆的新型高效启动子盐诱导功能元件及其应用。本专利技术所述的大豆高效启动子盐诱导功能元件，其特征在于：所述盐诱导功能元件命名为大豆高效启动子盐诱导功能元件GmBM1，该盐诱导功能元件的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其与拟南芥TUB2启动子融合的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术还提供了一种含有上述大豆高效启动子盐诱导功能元件的植物双荧光报告载体，其特征在于：所述载体命名为植物双荧光报告载体pGmBM1-pGreenII-0800LUC，该载体克隆区域核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。本专利技术所述大豆高效启动子盐诱导功能元件在提高植株盐胁迫耐受性中的应用。其中：所述植株优选是大豆或拟南芥。进一步的，所述拟南芥是Col-0野生型，大豆品种是圣豆9号。本专利技术所述大豆启动子盐诱导功能元件受盐胁迫诱导能高效启动目标基因表达。通过对GmNAC4转录因子识别并结合的下游基因的启动子序列分析，发现了盐胁迫下GmNAC4调节的大部分下游基因的启动子区域都含有一段保守的序列(pGmBM1)：CCTCCACCC(见图1)。将该功能元件融合拟南芥TUB2启动子构建pGmBM1::pGreenII-0800LUC载体(见图2)转入拟南芥叶片原生质体中，通过拟南芥和大豆叶肉细胞原生质体瞬时转染体系，检测盐、非盐条件下启动子LUC质粒转化的原生质体相对荧光素酶活性，结果表明该功能元件可快速高效的响应高盐诱导(见图3)。实验证实：本专利技术所述大豆启动子盐诱导功能元件能够在盐诱导条件下上调目标基因的表达，可望用于转基因耐盐植物的培育。本专利技术有益效果体现在：本专利技术首次发现了得到了大豆启动子盐诱导功能元件，通过拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时转染体系，经过比较分析证明，转基因拟南芥原生质体能在盐诱导下较非盐条件下能更高效的表达LUC报告基因。预示本专利技术所述的盐诱导功能元件可广泛用于培育抗盐的植物品种及转基因耐盐作物的相关功能研究。附图说明图1为启动子盐诱导功能元件：pGmBM1。图2为pGmBM1::pGreenII-0800LUC载体T-DNA图谱。图3为启动子盐诱导功能元件在盐和非盐条件下相对荧光素酶测定结果，其中，mock：为转化原生质体正常培养6h的相对荧光素酶活性；NaCl：为转化原生质体150mMNaCl处理6h的相对荧光素酶活性；-：阴性对照，为无启动子驱动的pGreenII空载对照相对荧光素酶活性；+：阳性对照，为35S::pGreenII，35S启动子驱动的相对荧光素酶活性。具体实施方式实施例1大豆圣豆9号基因高效启动子盐诱导功能元件的获得根据已报到的大豆圣豆9号转GmNAC4大豆植株在盐/非盐条件下的RNAseq结果，找到高盐胁迫下受转录因子GmNAC4上调表达的基因，利用http://meme-suite.org/网站比较这些基因的启动子区段共同含有的保守序列—CCTCCACCC，并设计特异性引物将该段序列与拟南芥TUB2启动子融合，命名为pGmBM1。1.1pGmBM1的克隆高保真酶HIFI扩增的反应体系如下(20μl体系)：扩增条件如下：反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。1.2克隆基因片段的纯化回收(天根试剂盒)1)将切下带有目的片段的凝胶放入1.5ml离心管并称凝胶重量，加入3倍体积的溶胶液，60℃溶胶10min，溶胶期间不断的翻转；2)凝胶完全融化后，全部吸取到回收柱中，放置片刻；3)室温，12000rpm，离心30Sec，弃溶液；4)在柱中加入700μl的漂洗液，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；5)在柱中加入500μl的漂洗液，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；6)空柱，12000rpm，离心2min；7)回收柱开盖晾干1-2min，放入新的干净的1.5ml离心管，加入60℃预热的40μl灭菌水或者EB缓冲液，放置2min；8)12000rpm离心1min，所得溶液即为回收片段。1.3连接pGmBM1与T载体反应体系如下(20μl体系)：16℃过夜连接。1.4大肠杆菌的质粒转化(无菌操作)(1)将1-5μl质粒DNA或者连接产物加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；(2)42℃，温水浴热激90sec，立即冰浴2-3min；(3)加入1mlLB培养基，37℃培养40-50min；(4)室温，4000rpm，离心3min，收集菌体；(5)将菌涂布于含有相应抗生素的培养平板上，37℃倒置培养过夜。1.5大肠杆菌PCR验证反应体系如下(20μl体系)：扩增条件如下：反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。1.6DNA测序挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Amp(50mg/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大豆高效启动子盐诱导功能元件，其特征在于：所述盐诱导功能元件命名为大豆高效启动子盐诱导功能元件GmBM1，该盐诱导功能元件的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其与拟南芥TUB2启动子融合的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种大豆高效启动子盐诱导功能元件，其特征在于：所述盐诱导功能元件命名为大豆高效启动子盐诱导功能元件GmBM1，该盐诱导功能元件的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其与拟南芥TUB2启动子融合的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。2.一种含有权利要求1所述大豆高效启动子盐诱导功能元件的植物双...

【专利技术属性】
技术研发人员：向凤宁，王楠，李朔，刘振华，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37