本发明专利技术公开了一种用于实时检测植物体内水杨酸水平的植物质粒表达载体,其中，通过把该质粒载体接种到植物体中，实时检测植物体中SA水平，其中，所述的质粒载体从右到左包括如下结构：T‑DNA右边界元件序列‑35S启动子元件序列‑第一酶切位点‑NPR1的泛素‑26s蛋白酶体降解元件基因序列‑第一接头序列‑荧光序列‑第二接头序列‑细胞核定位蛋白(NLS)序列‑终止子序列‑35S启动子序列‑T‑DNA左边界序列，其中，该质粒载体所表达的融合蛋白能够特异被SA所以降解。通过该质粒载体在植物体中的表达，可以实时监测植物体内的SA的水平。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中一种用于反映活体植物内的水杨酸水平及其变化的植物表达载体。
技术介绍
水杨酸(salicylic acid,SA)是植物体内普遍存在的一种简单的小分子酚类化合物，化学名称为“邻羟基苯甲酸”，是肉桂酸的衍生物。SA最早发现于柳树的叶和树皮中，1838年Raffaele Piria将这种有效组分命名为水杨酸。鉴于SA由植物自身合成，含量较低，于韧皮部运输，且在植物生热、开花、侧芽萌发、性别分化等生长发育过程中起着重要的调节作用，被确认为一种植物激素。SA在植物体内的存在形式主要有游离态和结合态两种形式，结合态SA是游离SA与葡萄糖结合形成无活性的水杨酸-2-O-β-葡萄苷(SAG)，存在于细胞内部，能防止大量游离SA对植物细胞可能产生的毒害作用。特定情况下，SAG能释放到细胞间隙，转化为游离SA，游离SA进入细胞，诱导防卫反应的发生。陆续的研究表明，SA不仅可以调节植物的某些生长发育过程，还是激活植物过敏反应(hypersensitive response,HR)和系统获得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)的重要内源信号分子，与植物抗盐性、抗旱性、抗热性和重金属胁迫等有相关。此外，SA在农业上常用于保鲜花卉、延缓果实成熟而提高好果率。SA与植物抗胁迫的关系一直是研究的热点，目前已经明确SA可作为植物抗病反应所需的信号分子来激活植物防御保护机制，在植物信号传导和抗逆反应中起着关键作用。目前，国内报道测定SA的方法有紫外分光光度法、离子色谱法、色谱-质谱连用法，主要对于废水、食品、医药中SA的含量进行测定，鲜有对植物样品的提取测定。国外文献主要采用高效液相色谱法(HPLC)对植物样品中的SA水平进行分析，测定受HPLC流动相、检测器等诸多因素的影响，更重要的是无法对活体植物内的SA进行实时监测。实时监测活体植物中水杨酸的水平是深入研究其作用和抗病机理的必要前提。
技术实现思路
为了解决上述的技术问题，本专利技术的目的是提供一种实时反映植物体内水杨酸水平的方法及其专用检测植物体内SA的融合蛋白以及表达载体。一方面，本专利技术提供一种融合蛋白，该蛋白包括NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元件的基
因所编码的蛋白和荧光素基因所编码的蛋白。或者该融合蛋白为NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元件的基因和荧光素基因所编码，所表达。该融合蛋白可以专一，特异地被SA降解，相反，SA不会单独降解荧光素基因所编码的蛋白或者NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元件所编码的蛋白，即NPR1的泛素基因所编码的蛋白或者荧光素基因所编码的蛋白均不会受SA诱导降解。在一些优选的方式中，该融合蛋白是通过质粒载体转入到表达载体来表达的。优选的，所述的质粒载体的结构从左到右顺次包括：T-DNA右边界元件序列-35S启动子元件序列-第一酶切位点-目的基因序列-第一接头序列-荧光序列-第二接头序列-细胞核定位蛋白(NLS)序列-终止子序列-35S启动子序列-T-DNA左边界序列。另一方面，本专利技术一种质粒载体，其中，通过把该质粒载体接种到植物体中，实时检测植物体中SA水平，其中，所述的质粒载体从右到左包括如下结构：T-DNA右边界元件序列-35S启动子元件序列-第一酶切位点-目的基因序列-第一接头序列-荧光序列-第二接头序列-细胞核定位蛋白(NLS)序列-终止子序列-35S启动子序列-T-DNA左边界序列。再一方面，本专利技术提供的检测植物体内水杨酸水平的方法，将含有来源于番茄的SA响应蛋白NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元件的基因片段构建到入的植物表达载体中，形成可以表达SA诱导降解的Venus YFP融合蛋白的载体，重组载体转入表达载体中(例如农杆菌)；将该农杆菌浸润植物；48小时候采用荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白对SA的反应介导融合蛋白表达，通过荧光共聚焦显微镜可以检测植物水杨酸的水平。所述的植物表达载体从右到左包括如下结构：T-DNA右边界元件序列-35S启动子元件序列-第一酶切位点-目的基因序列-第一接头序列-荧光序列-第二接头序列-细胞核定位蛋白(NLS)序列-终止子序列-35S启动子序列-T-DNA左边界序列。在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，所述的T-DNA左边界元件序列为Seq ID No:7所示。在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，所述的T-DNA右边界元件序列为Seq ID No:8所示。在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，所述的35S启动子元件序列为Seq ID No:9所示。在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，所述的第一接头序列为Seq ID No:10所示.在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，荧光蛋白序列为Seq ID No:11所示。在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，第二接头序列为Seq ID No:12所示。在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，细胞核定位蛋白(NLS)序列为Seq ID No:13所示。在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，Bar序列为Seq ID No:14所示。在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，终止子序列为Seq ID No:15所示。在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，所述的第一酶切位点为AgeI酶切位点；第二酶切位点为SpeI酶切位点。在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元件的基因为Seq ID No:5所示。所述NPR1降解元件的氨基酸序列Seq ID No:6所示。本专利技术提供制备检测植物体内水杨酸水平的表达载体的构建方法，该方法包括如下步骤：1)、从番茄中获得NPR1降解元件的编码基因序列，以番茄cDNA为模板，以引物对IK B-F1/IKB-R1所述的引物对进行PCR扩增，IKB-F1/IKB-R1为Seq ID No:1，Seq ID No:2所示；扩增的PCR产物纯化后经测序获得全序列，长度120bp(Seq ID No:5)。2)、步骤1中获得的NPR1降解元件的编码基因为模板，以引物对IKB-F2/IKB-R2扩增；引物对IKB-F2(带有Age1酶切位点NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件5’-端扩增正向引物/IK B-F1(带有Spe1酶切位点NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件3’-端扩增反向引物)为Seq ID No:3，Seq ID No:3所示；3)、采用SpeI和AgeI将步骤2中纯化的扩增目的片段进行酶切，并与经SpeI和AgeI双酶切的pjp743载体进行连接，连接的系统和步骤如下：采用10μL体系反应，其中10×Liga se Buffer 1μL，SpeI和AgeI双酶切线性化克隆载体pjp743 120ng，NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件片段120ng，Ligase 0.4μl，最后用ddH2O调整体系至10μL，轻轻混匀各组分；置于16℃反应30min；反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5min；然后将连接产物转入大肠杆菌，挑选具有全长插入的克隆，测序筛选出1个具有NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件基因序列的克隆；提取包含NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件质粒的克隆；通过电击法将其本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于实时检测植物体内水杨酸水平的植物质粒表达载体,其中，通过把该质粒载体接种到植物体中，实时检测植物体中SA水平，其中，所述的质粒载体从右到左包括如下结构：T‑DNA右边界元件序列‑35S启动子元件序列‑第一酶切位点‑NPR1的泛素‑26s蛋白酶体降解元件基因序列‑第一接头序列‑荧光蛋白序列‑第二接头序列‑细胞核定位蛋白(NLS)序列‑终止子序列‑35S启动子序列‑T‑DNA左边界序列，其中，该质粒载体所表达的融合蛋白能够特异被SA所以降解。
【技术特征摘要】
1.一种用于实时检测植物体内水杨酸水平的植物质粒表达载体,其中，通过把该质粒载体接种到植物体中，实时检测植物体中SA水平，其中，所述的质粒载体从右到左包括如下结构：T-DNA右边界元件序列-35S启动子元件序列-第一酶切位点-NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元件基因序列-第一接头序列-荧光蛋白序列-第二接头序列-细胞核定位蛋白(NLS)序列-终止子序列-35S启动子序列-T-DNA左边界序列，其中，该质粒载体所表达的融合蛋白能够特异被SA所以降解。2.根据权利要求1所述的质粒载体，其中，所述的T-DNA左边界元件序列为Seq ID No:7所示；所述的T-DNA右边界元件序列为Seq ID No:8所示；所述的35S启动子元件序列为Seq ID No:9所示；所述的第一接头序列为Seq ID No:10所示；荧光蛋白序列为Seq ID No:11所示；第二接头序列为Seq ID No:12所示；细胞核定位蛋白(NLS)序列为Seq ID No:13所示；Bar序列为Seq ID No:15所示；第一酶切位点为AgeI酶切位点；第二酶切位点为SpeI酶切位点；NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元件基因为Seq ID No:5所示。3.一种检测植物体内水杨酸水平的方法，将含有来源于番茄的SA响应蛋白NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元件的基...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵晋平，李赛赛，燕飞，程晔，陈剑平，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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