一种香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因启动子的关键响应元件及其筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因启动子的关键响应元件及其筛选方法，该关键响应元件是以巴西蕉基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物，通过PCR方法扩增获得的DNA片段。本发明专利技术设计不同长度的香蕉MaGBSSI‑3基因启动子缺失片段，筛选得到MaGBSSI‑3基因启动子的关键相应元件，这为如何有效调控香蕉直链淀粉的合成，以满足食品、医疗、工业等行业对不同含量直链淀粉的需求提供了研究方向，同时为其他植物GBSS基因的研究提供了借鉴。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体而言，本专利技术涉及一种香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因启动子的关键响应元件及其筛选方法。
技术介绍
香蕉是热带、亚热带地区重要的经济作物，是仅次于柑橘的世界第二大水果。淀粉作为香蕉果实中的主要组成成分，又促使其被联合国粮农组织(FAO)认定为仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物，是超过4亿人的口粮(Englberger et al.,2006)。然而，随着香蕉产业的快速发展和人们生活水平的迅速提高，对香蕉果实品质的要求也越来越高。将现代生物技术运用于香蕉品质改良中，可以解决一些用常规方法难以解决的问题。近年来，香蕉生物技术取得了很大的发展，一些控制重要农艺性状基因的相继分离并在香蕉中遗传转化成功(Sreedharan et al.,2013；Rustagi et al.,2015；Tripathi et al.,2015；Elitzur et al.,2016)为用基因工程技术来改良香蕉果实品质奠定了良好的基础。目前，我国香蕉优质果率不足30％，大多数香蕉果实后熟过程中出现硬心、糯性差、糖分含量偏低、抗性淀粉含量不稳定等品质问题。直链淀粉是香蕉果实的主要成分之一，它的含量直接决定着果实糯性、甜味及抗性淀粉含量等品质。直链淀粉合成酶基因(GBSS)编码结合在淀粉颗粒上的淀粉合成酶，又称为颗粒结合型淀粉合成酶，是影响直链淀粉合成的一个关键酶基因。前期研究发现GBSSI-3基因只在香蕉果实中高效表达，因此它是专一性表达的基因(Miao et al.,2014)。植物基因工程中常用组成型启动子(如35S)来调控外源基因的表达，但存在一些缺点，如：35S启动子能促使外源基因在双子叶植物中获得较高的表达，但在单子叶植物中驱动基因表达能力不强；35S驱动的表达无明显的组织和器官专一性，产生大量异源表达产物甚至有毒物质，导致植物代谢失衡影响其正常生长发育甚至死亡。应用组织特异性启动子则可以避免这种影响。因此，希望从香蕉直链淀粉合成酶基因中分离出能在香蕉果实中专一表达的启动子和表达调控元件，从而能在单子叶植物、特别是包括香蕉在内的淀粉转化型作物中驱动外源基因表达，从而提高作物产量，改善淀粉品质。但是MaGBSSI-3的表达调控机制目前还不完全清楚，可能受多个水平、多种因子的协同调控，需要进一步研究确认。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，从基因启动子的响应元件角度进行研究，发现了香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因MaGBSSI-3启动子的关键响应元件。本专利技术的第一个方面是提供一种香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因启动子的关键响应元件，其是以巴西蕉基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物，通过PCR方法扩增获得的DNA片段。其中，所述关键响应元件为113bp。本专利技术的第二个方面是提供一种重组载体，其为含有本专利技术第一个方面所述的关键响应元件的载体。其中，所述载体为载体或病毒载体。优选地，所述重组载体为利用Sac I和BamHI两个限制性酶切位点将本专利技术第一个方面所述的关键响应元件替换到pVKH-35S-GUS-pA表达载体的CaMV35S启动子处得到的表达载体。本专利技术的第三个方面是提供一种香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因启动子的关键响应元件的筛选方法，包括以下步骤：(1)以巴西蕉基因组DNA为模板，采用如下7组引物对，获得碱基序列为1075bp、1051bp、933bp、645bp、453bp、293bp和113bp的香蕉MaGBSSI-3基因启动子缺失片段，其中，7组引物对的3′端引物序列相同为SEQ ID NO.8所示，5′端引物序列分别为：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；(2)利用Sac I和BamHI两个限制性酶切位点将步骤(1)得到的不同的香蕉MaGBSSI-3基因启动子缺失片段替换到pVKH-35S-GUS-pA表达载体的
CaMV35S启动子处得到的表达载体；(3)利用步骤(2)得到的表达载体转化香蕉果实薄片，分化培养，观察基因GUS染色情况，推测最小缺失片段113bp为关键响应元件。本专利技术的第四个方面是提供一种DNA，其是以巴西蕉基因组DNA为模板，采用3′端引物序列为SEQ ID NO.8所示，5′端引物序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或者SEQ ID NO.7所示的引物对，通过PCR方法扩增获得的DNA片段。本专利技术的第五个方面是提供一种引物组，所述引物组含有核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对中的一种或多种。本专利技术设计不同长度的香蕉MaGBSSI-3基因启动子缺失片段，筛选得到MaGBSSI-3基因启动子的关键相应元件，这为如何有效调控香蕉直链淀粉的合成，以满足食品、医疗、工业等行业对不同含量直链淀粉的需求提供了研究方向，同时为其他植物GBSS基因的研究提供了借鉴。附图说明图1为MaGBSSI-3基因启动子缺失片段电泳图：M为DL 2000marker，A-G为MaGBSSI-3基因启动子缺失片段；图2为MaGBSSI-3基因启动子缺失片段表达载体构建示意图；图3为重组表达载体双酶切验证，其中，M1为DL 2000Marker，M2为DL 10000Marker，A-P为双酶切及对照目的条带；图4为不同MaGBSSI-3基因启动子缺失片段转化香蕉果实后的GUS染色。具体实施方式下面参照附图，结合具体的实施例对本专利技术作进一步的说明，以更好地理解本专利技术。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术
或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。1.MaGBSSI-3基因启动子5′端缺失为了对已获得的MaGBSSI-3的启动子响应元件进一步研究，通过对启动子序列的生物信息学分析，将该启动子片段进行不同长度的5′端缺失及瞬时表达载体的构建。以已克隆得到的启动子全长为模板，设计5′端缺失引物序列(3′端引物序列相同)，克隆对应的启动子缺失片段，其引物序列如下：引物名称引物序列(5′-3′)P-FCGAGCTCGTGTTCACTTCTTCCACTP-1051-FCGAGCTCGAGGGTCTTCGTTGATCACP-933-FCGAGCTCGAAGGTAAGGTGTGGGGAP-645-FCGAGCTCGCATATGGTACGATTCTTP-453-FCGAGCTCGCGGTTTTGTTCGTCCTTP-293-FCGAGCTCGACCGACGGGTATGCTAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因启动子的关键响应元件，其特征在于，其是以巴西蕉基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物，通过PCR方法扩增获得的DNA片段。

【技术特征摘要】
1.一种香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因启动子的关键响应元件，其特征在于，其是以巴西蕉基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物，通过PCR方法扩增获得的DNA片段。2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述关键响应元件为113bp。3.一种重组载体，其特征在于，其为含有权利要求1所述的关键响应元件的载体。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述载体为载体或病毒载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，其为利用Sac I和BamHI两个限制性酶切位点将权利要求1所述的关键响应元件替换到pVKH-35S-GUS-pA表达载体的CaMV35S启动子处得到的表达载体。6.一种香蕉果实颗粒结合淀粉合成酶基因启动子的关键响应元件的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以巴西蕉基因组DNA为模板，采用如下7组引物对，获得碱基序列为1075bp、1051bp、933bp、645bp、453bp、293bp和113bp的香蕉MaGBSSI-3基因启动子缺失片段，其中，7组引物对的3′端引物序列相同为SEQ ID NO.8所示，5′端引物序列分别为：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、S...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗红霞，孙佩光，金志强，徐碧玉，刘菊华，张建斌，贾彩红，王卓，王静毅，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：海南;46