本发明专利技术属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及特异性靶向沉默Kif2a的shRNA，首先是根据鼠源的Kif2a序列设计出19bp的目的片段，合成的目的片段两端带有合适的酶切位点，将目的片段连接到pSUPER载体上，连接转化，挑取阳性克隆鉴定，并进行DNA测序验证，最后进行沉默效率的检测。设计合成了能够靶向鼠源Kif2a的19bp的shRNA，序列为GCTGAAGAAG CCAAACTAT。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程中的DNA重组
,具体涉及特异性靶向沉默Kif2a的shRNA。
技术介绍
Kif2a是1995年在小鼠的脑中发现的一种驱动蛋白，属于驱动蛋白-13（Kinesin-13）家族中的一种，Kif2a分子由头部、颈部、马达区和尾部四个结构域组成，其头部结构主要参与分子的亚细胞定位，马达结构位于中间区域，与带正电荷的颈部结构域结合后在解聚微管的过程中发挥重要作用，主要通过ATP水解释放的能量使微管末端不稳定，进而触发微管发生解聚，其尾部结构位于分子的C末端，主要负责驱动蛋白的二聚化及ATP酶活性的调节。近期研究发现，Kif2a在神经系统发育过程中发挥一定的作用，其对神经元的形态发生和维持至关重要，另外有报导，Kif2a在乳腺癌的发生发展过程中同样起到一定的影响。因此，构建特异性沉默Kif2a的载体尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是合成特定的靶向沉默Kif2a的shRNA。为更加深入的研究Kif2a在疾病发生发展过程中的作用提供了有效的手段。本专利技术中所需要构建的主要是Kif2a的沉默表达载体。核心沉默表达载体构建分为两个大的步骤，首先是根据鼠源的Kif2a序列设计出19bp的目的片段，合成的目的片段两端带有合适的酶切位点，将目的片段连接到pSUPER载体上，连接转化，挑取阳性克隆鉴定，并进行DNA测序验证，最后进行沉默效率的检测。本专利技术中设计合成了能够靶向鼠源Kif2a的19bp的靶向沉默Kif2a的shRNA。序列为GCTGAAGAAG CCAAACTAT能够特异性沉默Kif2a的表达载体的构建包括以下步骤：第一步，序列设计根据鼠源Kif2a基因序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计特异性识别Kif2a的序列。第二步，沉默载体pSUPER-Kif2a shRNA的构建将沉默载体pSUPER双酶切后, 利用回收试剂盒回收线性化载体。将合成序列与其连接、转化、挑取单克隆进行验证，最后进行DNA序列测定。第三步，沉默靶蛋白效率的检测经转染细胞后提取蛋白，利用 western blot等试验手段检测沉默效率。附图说明：图1为pSUPER沉默载体BglⅡ和HindⅢ双酶切电泳图；左1：BglⅡ单酶切；左2：:HindⅢ单酶切；右1：BglⅡ和HindⅢ双酶切。图2为菌液PCR验证单克隆菌落是否正确；图3为Western blot免疫印迹分析，转入Kif2ashRNA沉默载体后Kif2a表达量降低90%。本专利技术中设计合成的19bp的目的片段，能够特异性的沉默Kif2a，同时也为构建Kif2a-shRNA提供关键的序列片段。由于Kif2a在神经元形态的发生及维持过程中发挥重要的作用，因此，Kif2a沉默载体的构建为Kif2a在神经发育过程中的研究提供了必要的工具。具体实施方式：实施例一: 特异性沉默靶标蛋白Kif2a的载体构建1、特异性沉默靶蛋白Kif2a的序列设计（1）根据鼠源Kif2a基因序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计，设计的原则：19bp的特异性结合Kif2a的序列的GC含量为45%-55%，退火温度45℃-65℃，同时避免起始端有两个以上的A，尾端不能有两个以上的T。将选取的片段进行BLAST人基因组比对，选择特异性序列。（2）以BglⅡ- N19-TT-loop- N’19-HindⅢ形式合成一段59bp序列，N’19为N19的反向互补，5’端为BglⅡ酶切位点，3’端为HindⅢ酶切位点。设计合成的片段分别靶向Kif2a的cDNA序列963- 981（Kif2a shRNA 1）和1452-1470（Kif2ashRNA 2），Scramble shRNA非特异靶向片段为GTGAGATCGTAGTGCGTGA。2、特异性沉默靶蛋白Kif2a的序列的合成与储存（1）将合成的两段olig溶解至50 µM，各取100µl混合。（2）95 ℃变性5min，快速转移至70 ℃水浴锅中，孵育10min，关闭水浴锅电源，过夜。（3）次日取出混匀，放在冰上备用，或者-20 ℃长期保存。3、沉默载体pSUPER-Kif2a shRNA的构建（1）取1µg pSUPER载体，BglⅡ和HindⅢ双酶切，电泳，回收线性大片段（图1）。（2）连接和转化。将线性pSUPER浓度调整至200ng/µl，连接反应（NEB公司的T4 DNA 连接酶）室温连接4小时，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布在具有Kan+的LB平板上。（3）阳性克隆鉴定。在转化平板上挑取单克隆摇菌，加入到2ml液体LB培养基中进行小摇，10h后进行菌液PCR（图2），并小提质粒送北京华大基因测序。实施例二:沉默靶蛋白效率的检测(1)Kif2a-shRNA以及control电转进入NLT细胞，48h提取细胞总蛋白，利用Western blot免疫印迹分析，转入Kif2a-shRNA沉默载体后，Kif2a表达量降低90%（图3）。序列表<110>东北师范大学<120>靶向沉默Kif2a的shRNA<141> 2015-01-15<160>19<210> 2<211> 19<212><213>人工序列<220><221> misc_RNA<222> (1)...(19)<223><400> 1GCTGAAGAAGCCAAACTAT。本文档来自技高网...
【技术保护点】
靶向沉默Kif2a的shRNA，其特征是序列为GCTGAAGAAG CCAAACTAT。
【技术特征摘要】
1. 靶向沉默Kif2a的shRNA，其特征是...
【专利技术属性】
技术研发人员：俞华莉，朱筱娟，孙栋，
申请(专利权)人：东北师范大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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