一种检测AQP‑4自身抗体的芯片、制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种检测AQP‑4自身抗体的芯片、制备方法及其应用，属于生物医药与生物检测技术领域，通过成功分离稳定表达AQP‑4的原代星状胶质细胞，同时采用基因沉默的方法，创造性的设计RNAi序列采用RNA干扰方法进行AQP‑4基因沉默，降低蛋白表达，获得了稳定不表达AQP‑4的阴性对照细胞，进一步设计成可长期保存的芯片，从而高效、准确、低成本的检测AQP‑4自身抗体，可广泛适于临床检测和科学研究。

A 4 AQP autoantibody detection chip, preparation method and application thereof

The invention relates to a method for detection of AQP 4 antibody chip, preparation method and application thereof, which belongs to the field of biological medicine and biological detection technology, primary astrocytes glial expression of AQP 4 separation stability through success, while using the method of gene silencing, RNAi sequence design creative using RNA interference AQP 4 gene silencing, reduced protein expression, the negative expression of AQP 4 stable cell control. Further designed for long-term preservation of chip, high efficiency, low cost, accurate detection of AQP 4 autoantibodies, and can be widely used in clinical detection and scientific research.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药与生物检测
，具体涉及一种检测AQP-4自身抗体的芯片、制备方法及其应用。
技术介绍
AQP(aquaporins)家族是近几年来逐渐被发现并认识的一类与水通透有关的膜转运蛋白，广泛分布于机体多处涉及水分子快速跨膜转运的部位，在维持体内水、电解质运输平衡中发挥着重要作用。目前，在哺乳动物组织中已发现13种水通道蛋白(AQP0-AQP12)。其中，AQP-4主要分布于肺、脑、眼等组织内，是脑和眼内分布最多、最广泛的水通道蛋白之一，兼有水运输平衡及渗透压感受器的双重功能，在脑和视网膜内水、电解质运输平衡以及眼内压恒定的调节等方面发挥着重要作用。多发性硬化(MultipleSclerosis,MS)和视神经脊髓炎(neuromyelitisoptica,NMO)是中枢神经系统最为常见的脱髓鞘疾病，视神经脊髓炎病人血清中存在着一种特异性自身抗体NMO-IgG，在NMO、MS、视神经炎(Opticneuritis，ON)、长节段横贯性脊髓炎(Longitudinallyextensivetranversemyelitis，LETM)患者的血清中阳性率较高，NMO患者尸检的病理显示病灶中血管周围有大量的免疫球蛋白和补体沉积、星型胶质细胞破坏和再生，其分布与AQP-4表达的分布相一致，目前的诊断标准也将NMO-IgG抗体(即为AQP-4自身抗体)阳性做为诊断视神经脊髓炎和视神经脊髓炎谱系疾病的的重要标志物，且AQP-4自身抗体的检测对于视神经脊髓炎的诊断价值已经被大量临床和基础研究所证实。目前，检测AQP-4自身抗体的主要技术有间接免疫荧光法(IndirectImmunofluorescence，IIF)、荧光免疫沉淀法(FluoroimmunoprecipitationAssay，FIPA)、放射免疫沉淀法(RadioimmunoprecipitationAssay,RIPA)、荧光免疫细胞染色法(Cell-BasedAssay，CBA)及酶联免疫吸附法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)。其中以CBA和FIPA的敏感性和特异性最为理想，因此被广泛认可。然而，CBA法应用的质粒为EGFP标记的人AQP4cDNA质粒及对照EGFPcDNA质粒，应用聚乙烯亚胺(PEI)或脂质体方法进行瞬时转染，平均检测周期超过两天，耗时长，人力物力损耗大，荧光效率不稳定，人为观察也费时费力，而且过表达的AQP-4一方面空间构型不能保证与天然状态相同，另一方面表达水平不稳定，这两个因素容易造成假阳性检测结果；FIPA法涉及到同位素的应用，环境危害性大大增加。此外，针对AQP-4自身抗体的检测国内目前只少数研究者利用CBA和FIPA做了科研研究，尚未常规应用于临床。综上可见，研究开发高效、敏感、准确的AQP-4自身抗体的检测方法及产品是科学研究及临床检测领域中亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测AQP-4自身抗体的芯片、制备方法及其应用，用以解决现有AQP-4自身抗体检测耗时耗力、成本高、检测结果不准确的问题。为实现上述目的，首先，本专利技术提供一种用于AQP-4基因沉默的RNAi序列，所述RNAi序列包括如下序列中的至少一对：stealth_121GAGAGAACATCATGGTGGCTTTCAAstealth_control_121GAGACAATACTGTGGTTCGTGACAAstealth_149GGTCTGGACTCAAGCTTTCTGGAAAstealth_control_149GGTGGCACTAACGTTCTGTGTCAAAstealth_595GCTGTGATTCCAAACGGACTGATGTstealth_control_595GCTAGTTCCAACAGGCAGTATGTGTstealth_710CCGATCCTTTGGACCTGCAGTTATCstealth_control_710CCGTCCGTTCAGGTCGACTTATATC。技术方案二，本专利技术还提供一种AQP-4基因沉默的星状胶质细胞，所述星状胶质细胞借助上述RNAi序列进行AQP-4基因沉默，AQP-4的蛋白敲除效率不低于65％。技术方案三，本专利技术还提供一种检测AQP-4自身抗体的芯片，所述芯片上包括检测孔和阴性对照孔，所述检测孔由原代分离的正常星状胶质细胞依次经培养、4％多聚甲醛固定、洗涤、含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液浸没后并密封形成；所述阴性对照孔由原代分离的正常星状胶质细胞依次经培养、借助技术方案1所述RNAi序列进行AQP-4基因沉默、4％多聚甲醛固定、洗涤、含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液浸没后并密封形成。优选的，所述阴性对照孔的细胞AQP-4蛋白敲除效率不低于65％。优选的，所述检测孔和阴性对照孔为分别设置在聚碳酸酯板上、并借助联通沟形成联通结构的凹槽。更优选的，所述凹槽直径为6mm，深度为0.5mm；联通沟的宽度为1mm，深度为0.5mm。技术方案四，本专利技术还提供上述检测AQP-4自身抗体的芯片的制备方法，所述芯片上包括检测孔和阴性对照孔，所述方法包括以下步骤：1)将原代分离的星状胶质细胞以1×105个/mL的浓度、0.1mL/孔的量分别接种至芯片的检测孔和阴性对照孔内，37℃、5％CO2条件下培养24-48h；2)借助权利要求1所述的RNAi序列及RNA干扰试剂盒对阴性对照孔的细胞进行干扰处理48h；3)对检测孔和经干扰处理的阴性对照孔内的细胞依次进行PBS磷酸盐缓冲液洗涤、4％多聚甲醛固定15-30min、PBS磷酸盐缓冲液浸泡15-40min，最后分别加入含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液并密封，避光4℃保存。优选的，所述步骤1)培养时芯片置于装有蒸馏水的培养皿内，下部以载破片垫起。可以避免芯片干燥。技术方案五，本专利技术还提供检测AQP-4自身抗体的芯片在制备检测AQP-4抗体的产品中的应用。本专利技术方法具有如下优点：(1)本专利技术所提供的用于AQP-4基因沉默的RNAi序列可对AQP-4蛋白有效敲除，其设计科学合理，合成方法简单，成本低，应用时敲除效率高；(2)本专利技术所提供的AQP-4基因沉默的星状胶质细胞AQP-4蛋白敲除效率不低于65％，使得阴性对照组结果更准确可靠，大大避免了假阳性结果的出现；(3)本专利技术所提供的检测AQP-4自身抗体的芯片结构及制备方法简单，检测过程用时少，操作步骤简单，同步设置检测孔和阴性对照孔，保证了检测结果准确可靠，应用高效、方便、安全，且检测孔和阴性对照孔结构、大小设置科学合理，在检测时所需样本量少，也大大降低了检测成本；进一步优化的技术方案中，提供了星状胶质细胞的原代分离方法，能高效大量获得稳定表达纯天然构象AQP-4蛋白的细胞，同时获得不表达AQP-4的阴性对照细胞，与其他转染AQP-4的细胞相比，原代分离星状胶质细胞上的AQP-4蛋白形成的四聚体晶格结构对NMO-IgG的捕获最为接近患者体内发生的生物过程，结果更可靠准确；(4)本专利技术提供的RNAi、细胞、芯片等适合大规模生产，方便长期保存，其应用范围广阔，成本低，对临床检测和科学研究意义重大。附图说明图1为本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于AQP‑4基因沉默的RNAi序列，其特征在于，所述RNAi序列包括如下序列中的至少一对：stealth_121 GAGAGAACATCATGGTGGCTTTCAAstealth_control_121 GAGACAATACTGTGGTTCGTGACAAstealth_149 GGTCTGGACTCAAGCTTTCTGGAAAstealth_control_149 GGTGGCACTAACGTTCTGTGTCAAAstealth_595 GCTGTGATTCCAAACGGACTGATGTstealth_control_595 GCTAGTTCCAACAGGCAGTATGTGTstealth_710 CCGATCCTTTGGACCTGCAGTTATCstealth_control_710 CCGTCCGTTCAGGTCGACTTATATC。

【技术特征摘要】
1.一种用于AQP-4基因沉默的RNAi序列，其特征在于，所述RNAi序列包括如下序列中的至少一对：stealth_121GAGAGAACATCATGGTGGCTTTCAAstealth_control_121GAGACAATACTGTGGTTCGTGACAAstealth_149GGTCTGGACTCAAGCTTTCTGGAAAstealth_control_149GGTGGCACTAACGTTCTGTGTCAAAstealth_595GCTGTGATTCCAAACGGACTGATGTstealth_control_595GCTAGTTCCAACAGGCAGTATGTGTstealth_710CCGATCCTTTGGACCTGCAGTTATCstealth_control_710CCGTCCGTTCAGGTCGACTTATATC。2.一种AQP-4基因沉默的星状胶质细胞，其特征在于，所述星状胶质细胞借助权利要求1所述RNAi序列进行AQP-4基因沉默，AQP-4的蛋白敲除效率不低于65％。3.一种检测AQP-4自身抗体的芯片，其特征在于，所述芯片上包括检测孔和阴性对照孔，所述检测孔由原代分离的正常星状胶质细胞依次经培养、4％多聚甲醛固定、洗涤、含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液浸没后并密封形成；所述阴性对照孔由原代分离的正常星状胶质细胞依次经培养、借助权利要求1所述RNAi序列进行AQP-4基因沉默、4％多聚甲醛固定、洗涤、含甘油10wt.％的PBS磷酸盐缓冲液溶液浸没后并密封形成。4.根据权利要求3所述的检测AQP-4自身抗体的芯片，其特征在于，所述阴性对照孔的细胞AQP-4蛋白敲除效率不低于65％。5.根据权利要求3所述的检测AQP-4自身抗体的芯片，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐辉，
申请(专利权)人：徐辉，
类型：发明
国别省市：北京;11