一种外源蛋白体内快速积累模型及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种外源蛋白体内快速积累模型及其制备方法与应用。本发明专利技术通过将外源蛋白表达基因克隆入表达载体中，得到能在啮齿类动物体内细胞表达的重组载体；分别于0d、15d、30d、60d和90d，通过啮齿类动物尾静脉将重组载体直接注射至啮齿类动物体内，得到外源蛋白体内快速积累模型。该外源蛋白体内快速积累模型能用于评估外源蛋白体内风险。本发明专利技术具有如下优点：在3个月内完成构建，可通过调整注射频率和注射剂量实现对体内外源蛋白剂量的调控；可同时构建多种待评估的外源重组载体，高通量评估；可放大外源蛋白暴露浓度，缩短评估周期。

【技术实现步骤摘要】
一种外源蛋白体内快速积累模型及其制备方法与应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种外源蛋白体内快速积累模型及其制备方法与应用。
技术介绍
对于转基因蛋白的长期累积的毒理性研究，常规的口服途径方法耗时长,成本高。“放大”肝组织内转基因成分浓度的方法可以成为口服给药毒理性研究的一种补充途径。通常情况下，转基因蛋白在植物细胞的保护下进入肠胃道后的命运推测为两种，即一部分转基因蛋白在坚硬的植物细胞壁的保护下抵制胃酸、胰蛋白酶等消化酶的作用进入肠组织(谢雯琦，马三梅，王永飞,等.转基因番茄口服疫苗的现状，问题及对策.中国生物工程杂志.2014,34(10)：94～100)。进入肠胃组织的转基因蛋白首先会通过门静脉进入肝脏，其中大部分接受肝组织内代谢酶的生物转化，随后代谢物通过血液进入体循环如被输送至心脏等器官，少量转基因蛋白原型仍保留在肝中(刘建平著.生物药剂学与药物动力学.人民卫生出版社.2011)。另一部分转基因蛋白在肠道释放后虽未被代谢，但会被水解酶降解为多肽易被小肠绒毛组织吸收，并通过跨细胞作用进入皮下组织进而进入体循环(LedleyFD.Somaticgenetherapyingastroenterology:approachesandapplications.Journalofpediatricgastroenterologyandnutrition.1992，14:328～337；ChangAGandWuGY.Genetherapy:applicationstothetreatmentofgastrointestinalandliverdiseases.Gastroenterology.1994,106：1076～1084)，或被小肠中M细胞胞吞、内化和胞饮等转运到上皮细胞下的淋巴组织，进而诱导免疫应答(谢雯琦,马三梅，王永飞,等.转基因番茄口服疫苗的现状，问题及对策.中国生物工程杂志.2014,34(10)：94～100；刘建平著.生物药剂学与药物动力学.人民卫生出版社.2011)。结合目前研究转基因植物的安全性评估结果可以验证上述推测，即肝脏组织中负责肝细胞代谢、应激反应和线粒体代谢的蛋白表达降低，这一结果(MalatestaMetal.Finestructuralanalysesofpancreaticacinarcellnucleifrommicefedongeneticallymodifiedsoybean.EuropeanJournalofHistochemistry.2003,47(4):385～388)提示，一部分转基因蛋白的肝代谢作物明显，随后，转化后的代谢物进入体循环后被输送至各组织而引起潜在的心脏疾病(TudiscoR,etal.FateoftransgenicDNAandevaluationofmetaboliceffectsingoatsfedgeneticallymodifiedsoybeanandintheiroffsprings.Animal.2010，4(10):1662～1671)，另一部分通过小肠吸收后进入体循环而引起淋巴器官的异常(SéraliniGE，etal.Long-termtoxicityofaRoundupherbicideandaRoundup-tolerantgeneticallymodifiedmaize.EnvironmentalSciencesEurope.2014，26：14)，最终，转基因蛋白的代谢物经肾脏排泄，从而又表现出对肾肿瘤形成的潜在影响。通过尾静脉注射质粒可实现外源基因在肝组织内的积累表达(KatsimpoulasM，etal.Animalmodelsforhydrodynamicgenedelivery.ChemicalBiology.2012，Chapter12：236～250；CrespoA，etal.Hydrodynamiclivergenetransfermechanisminvolvestransientsinusoidalbloodstasisandmassivehepatocyteendocyticvesicles.GeneTherapy.2005，12(11)：927～935；NakamuraS，etal.Improvementofhydrodynamics-basedgenetransferofnonviralDNAtargetedtomurinehepatocytes.BioMedResearchInternational.2013:928790；OliveiraNA，etal.Long-termhumangrowthhormoneexpressionandpartialphenotypiccorrectionbyplasmid-basedgenetherapyinananimalmodelofisolatedgrowthhormonedeficiency.TheJournalofGeneMedicine.2010，12(7):580～585；陈有尧和黄雪玲.大鼠尾静脉注射法.南方医科大学学报.2009，29(6)：1312)。此时，肝组织内转基因蛋白的去路推测如下，即一部分转基因蛋白在肝代谢酶作用下转化为代谢物并进入体循环，从而影响其它器官如心脏等；另一部分重组蛋白会以原型形式保留于肝组织内并被释放至血液中(刘建平著.生物药剂学与药物动力学.人民卫生出版社.2011)，引起相应的免疫应答。最终，转基因蛋白及代谢物经肾排泄。但是，已有的研究并没有规律性而言，从而，人们无法判断外源蛋白在体内的风险。因此，急需一种科学的，能有效对外源蛋白在体内风险的评估方法。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种外源蛋白体内快速积累模型的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的外源蛋白体内快速积累模型。本专利技术的再一目的在于提供上述外源蛋白体内快速积累模型的应用。本专利技术的又一目的在于提供一种外源蛋白体内风险的评估方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种外源蛋白体内快速积累模型的制备方法，包括如下步骤：(1)将外源蛋白表达基因克隆入表达载体中，得到能在啮齿类动物体内细胞表达的重组载体；(2)分别于0d、15d、30d、60d和90d，通过啮齿类动物尾静脉将重组载体直接注射至啮齿类动物体内，得到外源蛋白体内快速积累模型。所述的啮齿类动物包括大鼠和小鼠。所述的大鼠优选为Wistar大鼠。所述的小鼠优选为昆明小鼠、Balb/C小鼠或Swiss小鼠。所述的表达载体优选为pUBC载体。所述的pUBC载体优选为通过如下步骤制备得到：通过引物Ubc-F和Ubc-R对含有如SEQIDNO.3所示的UBC序列的模板进行扩增，使用NruI和NheI酶切后，再克隆入经NruI和NheI酶切的pSecTag2A载体中，得到pUBC载体；引物F：5’-CCAAGCTTCTGCACGGCGCTTC-3’；引物R：5’-GGTCTAGAGGCAGCCTTGGTGTCG-3’。所述的外源蛋白指的是原先在食物中不存在、由于转基因农产品转基因带入食物中的外源蛋白，包括5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外源蛋白体内快速积累模型的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将外源蛋白表达基因克隆入表达载体中，得到能在啮齿类动物体内细胞表达的重组载体；(2)分别于0d、15d、30d、60d和90d，通过啮齿类动物尾静脉将重组载体直接注射至啮齿类动物体内，得到外源蛋白体内快速积累模型。

【技术特征摘要】
1.一种外源蛋白体内快速积累模型的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将外源蛋白表达基因克隆入表达载体中，得到能在啮齿类动物体内细胞表达的重组载体；(2)分别于0d、15d、30d、60d和90d，通过啮齿类动物尾静脉将重组载体直接注射至啮齿类动物体内，得到外源蛋白体内快速积累模型。2.根据权利要求1所述的外源蛋白体内快速积累模型的制备方法，其特征在于：所述的啮齿类动物包括大鼠和小鼠。3.根据权利要求2所述的外源蛋白体内快速积累模型的制备方法，其特征在于：所述的大鼠为Wistar大鼠；所述的小鼠为昆明小鼠、Balb/C小鼠或Swiss小鼠。4.根据权利要求1所述的外源蛋白体内快速积累模型的制备方法，其特征在于：所述的表达载体为pUBC载体。5.根据权利要求1所述的外源蛋白体内快速积累模型的制备方法，其特征在于：所述的外源蛋白为5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶或来源于苏云金芽孢杆菌所产的...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵慧，江晓曦，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44