人绒毛膜促性腺激素的O-糖基化位点鉴定方法技术

本发明专利技术涉及人绒毛膜促性腺激素(hCG)的O

【技术实现步骤摘要】
人绒毛膜促性腺激素的O
‑
糖基化位点鉴定方法


[0001]本专利技术涉及蛋白质分析
，特别涉及人绒毛膜促性腺激素的O
‑
糖基化位点鉴定方法。

技术介绍

[0002]蛋白的糖基化是指蛋白质在酶的作用下被连接上糖链的翻译后修饰过程，是生物体内最主要的蛋白质翻译后修饰方式之一。糖基化修饰会影响到蛋白质的空间构象、成熟、稳定性和活性等方面，此外，糖基化可以参与细胞黏附、细胞识别、细胞分化等关键细胞过程，还可以参与个体发育、信号转导、免疫应答等重要生命活动。而且一些疾病(如癌症)的发生发展中也常常伴随着蛋白糖基化的异常变化。根据结合位点和连接方式的差异，蛋白的糖基化的包括N
‑
糖基化、O
‑
糖基化、C
‑
甘露糖化等形式，其中N
‑
糖基化和O
‑
糖基化较为常见。N
‑
糖基化发生在天冬酰胺的侧链，蛋白N
‑
糖基化位点的分析方法已经比较成熟，相比而言，蛋白O
‑
糖基化位点的鉴定分析目前仍存在着很大的技术瓶颈。O
‑
糖基化发生在丝氨酸或苏氨酸的侧链，不存在蛋白质特征修饰序列，缺少高效特异的O
‑
糖链释放酶，而且O
‑
糖链结构复杂多样，糖链具有的高分子量、糖苷键易断裂等特性导致不能通过在搜库过程中设置固定分子量修饰来实现，多重因素导致了O
‑
糖基化位点的分析非常困难。
[0003]人绒毛膜促性腺激素(hCG)是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白。hCG中具有多个携带寡糖侧链的O
‑
糖基化位点。虽然O
‑
糖基化并不影响hCG体外受体结合活性，但对hCG体内活性的发挥至关重要；O
‑
糖亦影响hCG的体内代谢，是hCG拥有较长半衰期的关键因素。在临床上，重组人绒毛膜促性腺激素(重组hCG)已被用于治疗无排卵性不育症、黄体功能不足、功能性子宫出血、隐睾症、男性性机能减退症、先兆流产或习惯性流产等疾病。此外，O
‑
糖基化也是重组hCG药物质量控制的重要监测指标。然而，由于hCG的β亚基C端的蛋白序列中有多个重复的丝氨酸单元，导致O
‑
糖基化位点的鉴定非常困难。
[0004]因此，很有必要开展hCG的O
‑
糖基化位点的鉴定分析。

技术实现思路

[0005]基于此，本专利技术的目的包括提供人绒毛膜促性腺激素(hCG)的O
‑
糖基化位点鉴定方法，为hCG的结构研究和质量控制提供重要依据。
[0006]在本专利技术的第一方面，提供一种人绒毛膜促性腺激素的O
‑
糖基化位点鉴定方法，其包括如下步骤：
[0007]获取hCG待测样品，其中的hCG具有如下的β亚基C末端肽段：FQDSSS
120
S
121
KAPPPS
127
LPSPS
132
RLPGPSDT
140
PILPQ
‑
COOH或者在第117位存在氨基酸突变；
[0008]采用糖苷内切酶切除N
‑
糖链，还原二硫键并封闭，采用蛋白内切酶酶切和进行O
‑
糖基化氨基酸残基的N端酶切，获得糖肽样品I；
[0009]采用液相色谱
‑
质谱联用法鉴定所述糖肽样品I的O
‑
HexNAc糖基化位点，所述β亚基C末端肽段的O
‑
HexNAc糖基化位点包括S121、S127、S132、S120和T140中的至少一个。
[0010]在本专利技术的第二方面，提供一种人绒毛膜促性腺激素的O
‑
糖基化位点鉴定方法，其包括如下步骤：
[0011]获取hCG待测样品，其中的hCG具有如下的β亚基C末端肽段：FQDSSSSKAPPPS
127
LPSPSRLPGPS
138
DTPILPQ
‑
COOH或者在第117位存在氨基酸突变；
[0012]采用包括糖苷内切酶的混合酶切除N
‑
糖链和部分O
‑
糖链，使至少一个氨基酸残基保留O
‑
HexNAc糖链，还原二硫键并封闭和采用肽链内切酶酶切，获得糖肽样品II；
[0013]采用液相色谱
‑
质谱联用法鉴定所述糖肽样品II的O
‑
HexNAc糖基化位点，所述β亚基C末端肽段的O
‑
HexNAc糖基化位点包括S127和S138中的至少一个。
[0014]在本专利技术的第三方面，提供一种人绒毛膜促性腺激素的O
‑
糖基化位点鉴定方法，其包括如下步骤：
[0015]获取hCG待测样品，其中的hCG具有如下的C末端肽段：FQDSSS
120
S
121
KAPPPS
127
LPSPS
132
RLPGPS
138
DT
140
PILPQ
‑
COOH或者在第117位存在氨基酸突变；
[0016]采用本专利技术的第一方面所述的O
‑
糖基化位点鉴定方法的步骤制备糖肽样品I，并采用所述的液相色谱
‑
质谱联用法鉴定所述糖肽样品I的O
‑
HexNAc糖基化位点；和/或，采用本专利技术的第二方面所述的O
‑
糖基化位点鉴定方法的步骤制备糖肽样品II，并采用所述的液相色谱
‑
质谱联用法鉴定所述糖肽样品II的O
‑
HexNAc糖基化位点；
[0017]所述β亚基C末端肽段的O
‑
HexNAc糖基化位点包括S121、S127、S132、S138、S120和T140中的一个或多个；
[0018]优选地，所述β亚基C末端肽段的O
‑
HexNAc糖基化位点包括S121、S127、S132、S120和T140中的一个或多个，还包括S127和S138中的一个或两个；
[0019]更优选地，所述β亚基C末端肽段的O
‑
HexNAc糖基化位点包括S120和T140中的一个或两个，还包括S121、S127和S132中的一个或多个，还包括S127和S138中的一个或两个。
[0020]本专利技术提供的人绒毛膜促性腺激素(hCG)的O
‑
糖基化位点鉴定方法，用于分析hCG的β亚基C末端肽段的O
‑
HexNAc糖基化位点。在一些实施例中(如LZM003)，hCG具有如SEQ ID No.:4所示的β亚基C末端肽段，该β亚基C末端肽段的氨基酸序列为FQDSSSSKAPPPSLP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人绒毛膜促性腺激素(hCG)的O
‑
糖基化位点鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：获取hCG待测样品，其中的hCG具有如下的β亚基C末端肽段：FQDSSS
120
S
121
KAPPPS
127
LPSPS
132
RLPGPSDT
140
PILPQ
‑
COOH或者在第117位存在氨基酸突变；采用糖苷内切酶切除N
‑
糖链，还原二硫键并封闭，采用蛋白内切酶酶切和进行O
‑
糖基化氨基酸残基的N端酶切，获得糖肽样品I；采用液相色谱
‑
质谱联用法鉴定所述糖肽样品I的O
‑
HexNAc糖基化位点，所述β亚基C末端肽段的O
‑
HexNAc糖基化位点包括S121、S127、S132、S120和T140中的至少一个。2.如权利要求1所述的O
‑
糖基化位点鉴定方法，其特征在于，具备如下一个或多个特征：(a1)依次采用所述糖苷内切酶切除N
‑
糖链，还原二硫键并封闭，采用所述蛋白内切酶酶切和进行O
‑
糖基化氨基酸残基的N端酶切，获得所述糖肽样品I；(a2)所述糖苷内切酶包括PNGase F酶；(a3)所述蛋白内切酶包括Glu
‑
C酶；和，(a4)使用SialEXO酶和OpeRATOR酶进行所述O
‑
糖基化氨基酸残基的N端酶切。3.如权利要求2所述的O
‑
糖基化位点鉴定方法，其特征在于，所述液相色谱
‑
质谱联用法为超高效液相色谱
‑
飞行时间质谱联用法；其中，超高效液相色谱的测试条件包括：色谱柱为Waters Acquity UPLC柱，BEH300 C18，1.7μm，2.1
×
100mm；流动相：由流动相A和流动相B组成，其中，所述流动相A为含有0.1％
±
(0～0.01％)甲酸的水溶液，所述流动相B为含有0.1％
±
(0～0.01％)甲酸的乙腈/甲酸混合液；流速：0.2
±
(0～0.02)mL/min；进样量：4
±
(0～0.4)μL；柱温：40
±
(0～4)℃；洗脱程序包括：0min：流动相B的体积百分比为1％
‑
5％；0
‑
50min：流动相B的体积百分比由1％
‑
5％上升到25％
‑
35％；50
‑
52min：流动相B的体积百分比由25％
‑
35％上升到95％
‑
100％；52
‑
57min：流动相B的体积百分比为95％
‑
100％；57
‑
58min：流动相B的体积百分比由95％
‑
100％降低至1％
‑
5％；58
‑
60min：流动相B的体积百分比为1％
‑
5％；可选地，飞行时间质谱的测试条件包括：正离子灵敏度模式；锥孔电压为40
±
1V；脱溶剂温度为350
±
5℃；锥孔气流为50
±
5L/Hr；脱溶剂气体为600
±
50L/Hr；质量扫描范围为100～2500Da；MS
E
高碰撞能量阶梯为20～50V。4.如权利要求1～3中任一项所述的O
‑
糖基化位点鉴定方法，其特征在于，具备如下一个或多个特征：(b1)采用所述糖苷内切酶切除N
‑
糖链的步骤包括：向样品中加入变性缓冲液进行变性，然后加入NP
‑
40水溶液、磷酸钠缓冲液和所述PNGase F酶，酶切去除N
‑
糖链；其中，所述变性缓冲液为含有十二烷基硫酸钠和二硫苏糖醇的缓冲液；(b2)采用所述蛋白内切酶酶切的步骤包括：向样品中加入尿素和所述Glu
‑
C酶，酶切切
割天冬酰胺和/或谷酰胺残基的C端肽键；和(b3)进行所述O
‑
糖基化氨基酸残基的N端酶切的步骤包括：向样品中加入所述SialEXO酶和所述OpeRATOR酶，酶切切割O
‑
HexNAc糖基化的丝氨酸和/或苏氨酸残基的N端肽键；可选地，所述的O
‑
糖基化位点鉴定方法还具备如下一个或多个特征：(c1)所述PNGase F酶溶液的酶用量为4～100U/微克蛋白样品，酶切温度为37
±
(0～0.5)℃，可选地，所述PNGase F酶溶液的酶用量为4～50U/微克蛋白样品，可选地，所述PNGase F酶溶液的酶用量为4～30U/微克蛋白样品，可选地，所述PNGase F酶溶液的酶用量为5
±
(0～0.5)U/微克蛋白样品；(c2)所述Glu
‑
C酶的酶用量为0.005～0.1微克/微克蛋白样品，酶切温度为37
±
(0～0.5)℃，可选地，所述Glu
‑
C酶的酶用量为0.005～0.05微克/微克蛋白样品，可选地，所述Glu
‑
C酶的酶用量为0.01～0.05微克/微克蛋白样品，可选地，所述Glu
‑
C酶的酶用量为0.03
±
(0～0.05)微克/微克蛋白样品；(c3)所述SialEXO酶的酶用量为0.2～2U/微克蛋白样品，酶切温度为37
±
(0～0.5)℃，可选地，所述SialEXO酶的酶用量为1
±
(0～0.5)U/微克蛋白样品，可选地，所述SialEXO酶的酶用量为1
±
(0～0.2)U/微克蛋白样品，可选地，所述SialEXO酶的酶用量为1
±
(0～0.1)U/微克蛋白样品；(c4)所述OpeRATOR酶的酶用量为0.2～2U/微克蛋白样品，酶切温度为37
±
(0～0.5)℃，可选地，所述OpeRATOR酶的酶用量为1
±
(0～0.5)U/微克蛋白样品，可选地，所述OpeRATOR酶的酶用量为1
±
(0～0.2)U/微克蛋白样品，可选地，所述OpeRATOR酶的酶用量为1
±
(0～0.1)U/微克蛋白样品；和(c5)所述采用蛋白内切酶酶切和进行O
‑
糖基化氨基酸残基的N端酶切的步骤中，酶切的pH条件各自独立地为7.5～8.5。5.如权利要求1～3中任一项所述的O
‑
糖基化位点鉴定方法，其特征在于，具备如下一个或两个特征：(1)所述β亚基C末端肽段的O
‑
HexNAc糖基化位点包括S120和T140中的至少一个；和(2)所述hCG待测样品中的hCG为重组hCG。6.一种人绒毛膜促性腺激素的O
‑
糖基化位点鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：获取hCG待测样品，其中的hCG具有如下的β亚基C末端肽段：FQDSSSSKAPPPS
127
LPSPSRLPGPS

【专利技术属性】
技术研发人员：邓巧春，杨嘉明，谢佳倩，邓钦培，容宜欣，路勇，关欣，
申请(专利权)人：珠海市丽珠单抗生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：