纯化逆转录病毒的试剂盒及纯化方法技术

本公开涉及一种纯化逆转录病毒的试剂盒及纯化方法，所述试剂盒包括纯化逆转录病毒的试剂组合，其包括第一淋洗液、第二淋洗液、洗脱液和聚阴离子化合物。采用本公开的纯化层析用组合物及方法，可以增加病毒的载量，将逆转录病毒的层析回收率提高2

【技术实现步骤摘要】
纯化逆转录病毒的试剂盒及纯化方法


[0001]本公开涉及生物领域，具体而言，特别涉及一种纯化逆转录病毒的试剂盒及纯化方法。

技术介绍

[0002]逆转录病毒又称反转录病毒，属于RNA病毒中的一种，遗传信息为RNA。逆转录病毒有三个亚科：肿瘤病毒亚科、慢病毒亚科、泡沫病毒亚科。逆转录病毒载体是以逆转录病毒基因组为基础，对其自身元件进行改造而发展起来的一类能够携带外源基因的病毒载体。逆转录病毒载体的基因组进入受体细胞后，在受体细胞的细胞质中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，并进入细胞核，DNA整合到受体细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞质中，表达目的蛋白或产生小RNA。逆转录病毒衍生载体成为基因治疗临床试验中应用最广泛的载体之一。目前，逆转录病毒的制备纯化工艺仍面临着巨大挑战。
[0003]慢病毒(Lentivirus)是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒，原发感染的细胞以淋巴细胞和巨噬细胞为主，慢病毒感染患者早期很难观察，大多经历长达数年的潜伏期，之后缓慢发病，因此称为慢病毒。与其他病毒载体相比，慢病毒有其独特的优点：
[0004](1)宿主更广泛：对于分裂和非分裂细胞均具有感染能力，对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率；
[0005](2)可稳定表达：慢病毒基因组可整合于宿主基因组，因此可以长时间、稳定表达外源基因；
[0006](3)可携带大约5kb或更长的外源基因片段：基于慢病毒载体的优点，其被广泛应用于RNAi、基因治疗以及转基因动物等研究中。体外构建能够表达siRNA的慢病毒载体，然后进行细胞转染，使其在细胞内转录siRNA，可发挥长期阻断基因表达的作用。同时，以慢病毒作为基因载体的多种基因疗法已在国内外开展临床研究，在基因治疗中拥有广阔的应用前景。
[0007]当使用逆转录病毒载体感染细胞时，通常需要浓缩病毒颗粒以获得高滴度及高纯度的逆转录病毒。现有的大规模逆转录病毒生产工艺包括：
[0008](1)包装逆转录病毒：贴壁培养或者悬浮培养；
[0009](2)收获并澄清逆转录病毒上清：悬浮培养先离心或过滤去除细胞后收获逆转录病毒上清液，贴壁培养直接收获逆转录病毒上清液，再用0.45μm膜过滤以进一步去除细胞碎片，收集的澄清液用于下一步超滤或层析纯化；
[0010](3)两步层析法纯化逆转录病毒：阴离子交换层析组合分子筛层析或者复合模式层析；层析工艺前后也可能需要增加超滤步骤；阴离子层析缓冲液一般为Tris
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HCl或PBS，淋洗缓冲液和盐浓度一般与平衡缓冲液一致(盐浓度一般≤0.3M NaCl)，洗脱盐浓度均≤2M NaCl；
[0011](4)核酸酶处理可在病毒包装阶段、澄清前或澄清后、阴离子层析后等步骤进行；
[0012](5)300
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750KDa切向流超滤UF/DF得到逆转录病毒成品，无菌过滤和冻存。
[0013]然而，该方法中，层析过程中所使用的层析液具有以下缺陷：
[0014](1)离子交换层析中逆转录病毒的回收率为50％左右或更低，且收率不稳定；
[0015](2)需要两步层析才能保证杂质残留在可接受水平。采用分子筛工艺则无法大规模放大生产。而复合模式层析，如Capto Core700等填料，一般为流穿模式纯化病毒，处理过程中样品体积会增加，无法通过层析达到浓缩的目的，需要增加超滤浓缩和换液过程；
[0016](3)当前缓冲体系下逆转录病毒在高盐条件下耐受时间短，一般仅半小时左右，阴离子层析高盐洗脱后需要立即稀释至≤0.3M NaCl的浓度(约需稀释4
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10倍)，增大了样本的操作体积和后续处理时间。此外，上述的超滤过程需要经过浓缩和透析两个步骤。
[0017]因此，急需提供一种层析收率高，步骤少且操作简单，耗时短的纯化逆转录病毒的试剂盒。

技术实现思路

[0018]为了解决现有技术中存在的问题，本公开的目的在于提供一种新的纯化逆转录病毒试剂盒及纯化方法，采用所述的试剂组合或试剂盒，可以提高逆转录病毒的回收率，纯化过程步骤少且操作简单，耗时短。
[0019]为了实现上述目的，本公开采用以下具体技术方案：
[0020]在一方面，本公开提供了一种逆转录病毒的纯化层析用组合物，其包括第一淋洗液、第二淋洗液和洗脱液，具体为：
[0021]所述第一淋洗液包括以下组分：柠檬酸、氯化钠和水；
[0022]所述第二淋洗液包括以下组分：缓冲液、氯化钠和水；
[0023]所述洗脱液包括以下组分：缓冲液、氯化钠和水。
[0024]任选地，所述试剂组合还包括聚阴离子化合物；优选地，所述聚阴离子化合物选自葡聚糖的聚阴离子化合物，优选硫酸葡聚糖的钠盐。
[0025]在另一方面，本公开提供一种纯化逆转录病毒的试剂盒，其包含前述的试剂组合。
[0026]在另一方面，本公开提供一种利用前述的试剂组合或前述的试剂盒纯化逆转录病毒的方法，其包括以下步骤：
[0027](1)获取逆转录病毒上清液；
[0028](2)澄清逆转录病毒上清液：
[0029]将步骤(1)获取的逆转录病毒上清液与聚阴离子化合物混合，过滤，得到澄清后逆转录病毒上清液；优选地，过滤前或过滤后添加核酸酶；
[0030](3)阴离子层析及洗脱：
[0031]将步骤(2)得到的澄清后逆转录病毒上清液上样阴离子膜层析或阴离子层析柱，上样完成后依次用第一淋洗液、第二淋洗液淋洗，再用洗脱液洗脱，收集含逆转录病毒的洗脱液；
[0032](4)纯化洗脱液；
[0033]任选地，所述方法还包括透析和/或浓缩。
[0034]在另一方面，本公开提供了一种利用前述的试剂组合、前述的试剂盒和/或前述的方法在制备纯化逆转录病毒中的用途。
[0035]本公开所取得的有益效果至少如下：
[0036]本公开的纯化层析用组合物在实施例应用过程中，专利技术人首次发现在淋洗液中添加柠檬酸具有以下功能：
[0037](1)使逆转录病毒与层析填料配基稳定结合，即将逆转录病毒固定在层析柱上，保证下一步第二淋洗液的高盐洗杂过程中仅洗脱杂质而不洗脱病毒；
[0038](2)有助于洗掉一部分HCP等杂质，使得在第一淋洗液和第二淋洗液的配合下，能够有效洗脱杂质而不洗脱病毒，大大提高逆转录病毒的回收率。如果不添加柠檬酸，仅仅0.5M的NaCl浓度就可以洗脱病毒，造成逆转录病毒回收率降低。同时，本公开的专利技术人还意外发现，洗脱液洗脱得到的病毒洗脱液在高盐条件下可保存20h而不失去感染活性，克服了现有缓冲体系逆转录病毒在高盐条件下耐受时间短的缺陷，得到的洗脱液可以直接进行下一步超滤透析，无需先稀释后浓缩的步骤，有效简化操作步骤，缩短处理时间。
[0039]进一步地，本公开的逆转录病毒纯化方法中，还首次发现通过调节澄清后逆转录病毒上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纯化逆转录病毒的试剂组合，其包括第一淋洗液、第二淋洗液和洗脱液，其中：所述第一淋洗液包括以下组分：柠檬酸、氯化钠和水；所述第二淋洗液包括以下组分：缓冲液、氯化钠和水；所述洗脱液包括以下组分：缓冲液、氯化钠和水；任选地，所述试剂组合还包括聚阴离子化合物；优选地，所述的聚阴离子化合物选自以下的一种或多种：葡聚糖的聚阴离子化合物、肝素钠、硫酸肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、多硫酸戊聚糖酯、硫酸纤维素、硫酸乙酸纤维素、萘磺酸衍生物、聚苯乙烯磺酸、聚羧酸或聚乙烯吡咯烷酮和/或包含前述任一化合物的抗细胞结团剂；优选地，所述聚阴离子化合物选自葡聚糖的聚阴离子化合物，优选为硫酸葡聚糖钠盐。2.根据权利要求1所述的试剂组合，其中，所述逆转录病毒选自肿瘤病毒、慢病毒和/或泡沫病毒中的一种或多种；优选地，所述逆转录病毒为慢病毒。3.根据权利要求1或2所述的试剂组合，其中，所述第一淋洗液中，柠檬酸的浓度为0.01M
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0.3M，优选0.02M
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0.15M，优选0.1M；优选地，氯化钠的浓度为0.025M
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0.5M，优选0.05M
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0.25M，优选0.15M；优选地，所述第一淋洗液的pH为5.0
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6.5，优选pH为6.0；优选地，所述第二淋洗液中，所述缓冲液为PB缓冲液或Tris缓冲液；优选地，所述PB缓冲液或Tris缓冲液的浓度为5
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150mM，优选10
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100mM，优选50mM；优选地，氯化钠的浓度为0.25M
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2.5M，优选0.5M
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1.2M，优选0.8M；优选地，所述第二淋洗液的pH为5.0
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6.5，优选pH为6.0；优选地，所述洗脱液中，所述缓冲液为PB缓冲液或Tris缓冲液；优选地，所述PB缓冲液或Tris缓冲液的浓度为5
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150mM，优选10
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100mM，优选50mM；优选地，氯化钠的浓度为2.0
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5M，优选2.5
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4M，优选2.8M；所述洗脱液的pH为5.0
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6.5，优选pH为6.0；优选地，所述的聚阴离子化合物的浓度为0.05g/L
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0.75g/L，优选0.1g/L
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0.5g/L，优选0.1g/L或0.5g/L。4.一种纯化逆转录病毒的试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯军，黄家妮，王晓韵，李濛，杨嘉明，
申请(专利权)人：珠海市丽珠单抗生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：