一种高效的猪流行性腹泻病毒纯化方法技术

本发明专利技术提供一种高效的猪流行性腹泻病毒纯化方法，涉及生物领域。该纯化方法，包括如下步骤：（1）在猪流行性腹泻病毒液中加入刀豆蛋白A和沉淀形成促进剂，混合作用；（2）离心，取沉淀；（3）于所述沉淀中加入解离液，解离，得到纯化后的病毒液。采用本发明专利技术方法纯化猪流行性腹泻病毒，除杂率超过90%，回收率超过90%，载量大且无需高价值设备。且无需高价值设备。

【技术实现步骤摘要】
一种高效的猪流行性腹泻病毒纯化方法


[0001]本专利技术涉及生物领域，具体涉及一种高效的猪流行性腹泻病毒纯化方法。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的仔猪腹泻是一种困扰养猪业发展的重要传染病，有流行病学调查显示：PEDV阳性样品检测率为62.1％～78.5％，阳性猪场比率为71.4％～83.5％，哺乳仔猪感染后死亡率高达90％以上。目前该病已成为世界养猪业的重要猪病之一，严重影响了生猪行业的健康发展，造成了巨大的经济损失。
[0003]现阶段，疫苗免疫是预防和控制猪流行性腹泻的主要手段。目前，PEDV疫苗大多未经过纯化，大量的杂质能够引起严重的副反应，现有的离心、膜过滤、层析等纯化方法中，离心和膜过滤因其分辨率不高，去杂蛋白能力非常有限，而层析技术虽然杂蛋白去除率较高，由于操作中使用的纯化材料和设备造价较高，阻碍了其在附加值低的兽用疫苗中的使用，所以开发新型高效、低成本的PEDV抗原纯化技术具有重要的意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种高效的猪流行性腹泻病毒纯化方法，该方法纯化效率高，成本低。
[0005]本专利技术的目的采用如下技术方案实现：
[0006]一种高效的猪流行性腹泻病毒纯化方法，包括如下步骤：
[0007](1)在猪流行性腹泻病毒液中加入刀豆蛋白A和沉淀形成促进剂，混合作用；
[0008](2)离心，取沉淀；
[0009](3)于所述沉淀中加入解离液，解离，得到纯化后的病毒液。
[0010]在本专利技术中，刀豆蛋白A加入到猪流行性腹泻病毒液中的终浓度为1～2.4μg/mL，所述猪流行性腹泻病毒液的病毒含量为106‑
10
7.5
TCID
50
/mL。
[0011]在本专利技术中，所述沉淀形成促进剂为硫酸软骨素a和硫酸葡聚糖的混合物。
[0012]在本专利技术中，步骤(2)中的离心速度为2000
‑
8000rpm。
[0013]在本专利技术中，步骤(1)硫酸软骨素a加入到猪流行性腹泻病毒液中的终浓度为0.2
‑
1.5mg/mL，硫酸葡聚糖加入到猪流行性腹泻病毒液中的终浓度为0.2
‑
1.5mg/mL。
[0014]在本专利技术中，步骤(3)中所述解离液中含有甘露糖、甲基
‑
α
‑
D
‑
吡喃甘露糖苷、六甘露糖
‑
二N
‑
乙酰葡糖胺中的一种或两种以上。
[0015]在本专利技术中，所述解离液中还含有异丙醇和NaCl。
[0016]在本专利技术中，所述解离液含有150
‑
450mM甲基
‑
α
‑
D
‑
吡喃甘露糖苷、5
‑
15nM的六甘露糖
‑
二N
‑
乙酰葡糖胺、10
‑
250mM NaCl和体积百分浓度为1
‑
6％的异丙醇。
[0017]在本专利技术中，所述解离液的溶剂是浓度为0.005M
‑
0.05M、pH为7.0
‑
8.0的Tris缓冲液或PB缓冲液。
[0018]在本专利技术中，步骤(1)中混合作用时的摇床转速为100
‑
500rpm，混合作用时间为1
‑
5小时；步骤(3)中解离时间为10～60分钟。
[0019]申请人筛选到一种能够特异性识别并直接沉淀PEDV病毒粒子的蛋白：刀豆蛋白A，能够高效纯化PEDV病毒粒子。采用刀豆蛋白A纯化PEDV病毒粒子具有如下有益效果：(1)除杂率可达95％。因为刀豆蛋白A(ConcanavalinA，缩写为Con A)与病毒粒子的相互作用具有高度的特异性，因此，可以去除包括牛血清白蛋白、细胞碎片等在内的绝大多数的杂质，除杂率可以媲美成本较高的层析技术。(2)回收率能够满足工业化大生产的需要。采用本专利技术方法纯化PEDV，PEDV病毒粒子回收率可达到95％左右。(3)载量大且无需高价值设备。细胞增殖的病毒液经简单的破碎及澄清等步骤，添加Con A和高效的沉淀形成促进剂后在室温条件下搅拌，再经一步低速离心即可收获浓缩的复合物，于复合物中添加高效的解离液，即可获得纯化的病毒。整个过程操作简便，易于放大，较层析方法有着更大的载量，并且不需要使用高成本的纯化设备，因此生产成本显著降低。
附图说明
[0020]图1是Con A添加量对纯化效果的影响，横坐标是刀豆蛋白A或植物血凝素的添加量，单位是μg，纵坐标是纯化后的病毒液或者解离液OD
450
值，Con A
‑
PEDV是Con A纯化所得PEDV病毒液，Con A
‑
Vero是采用Con A纯化的对照组解离液，PHA
‑
PEDV是PHA纯化所得PEDV病毒液，PHA
‑
Vero是采用PHA纯化的对照组解离液。
[0021]图2是各沉淀形成促进剂所对应纯化后的PEDV病毒液的OD
450
值，其中横坐标是组别，纵坐标是纯化后的病毒液OD
450
值。
[0022]图3是PEDV细胞培养液与刀豆蛋白A作用时间优化结果，其中横坐标是作用时间，单位是h；纵坐标是纯化后的病毒液的OD
450
值。
[0023]图4是最佳离心力优化结果，其中横坐标是离心速度，单位是rpm；纵坐标是OD
450
值。
●
代表病毒纯化组，
○
代表对照组。
[0024]图5是最佳离心时间优化结果，其中横坐标是离心时间，单位是min；纵坐标是OD
450
值。
[0025]图6是解离液缓冲体系的优化，其中横坐标是解离液组别，纵坐标是OD
450
值。
[0026]图7是PEDV病毒液标准曲线，横坐标是OD
450
值，纵坐标是lg(PEDV滴度)，标准曲线为y＝0.4939x+5.5878，y为lg(PEDV滴度)，x为OD
450
值。
具体实施方式
[0027]下面通过实施例对本专利技术进行进一步说明。
[0028]PEDV CV777株：公开于陈瑾,黄春娟,于晓明,侯立婷,乔绪稳,郑其升,侯继波.PEDV亚单位疫苗免疫增强剂的筛选.华北农学报.2016,31(2):205
‑
210。
[0029]本专利技术中的室温是指20
‑
30℃。
[0030]实施例一 双抗夹心ELISA方法定量检测PEDV病毒粒子
[0031]双抗夹心ELISA方法定量检测PEDV病毒粒子，具体操作过程如下：使用碳酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效的猪流行性腹泻病毒纯化方法，其特征在于包括如下步骤：(1)在猪流行性腹泻病毒液中加入刀豆蛋白A和沉淀形成促进剂，混合作用；(2)离心，取沉淀；(3)于所述沉淀中加入解离液，解离，得到纯化后的病毒液。2.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于刀豆蛋白A加入到猪流行性腹泻病毒液中的终浓度为1～2.4μg/mL，所述猪流行性腹泻病毒液的病毒含量为106‑
10
7.5
TCID
50
/mL。3.根据权利要求1或2所述纯化方法，其特征在于所述沉淀形成促进剂为硫酸软骨素a和硫酸葡聚糖的混合物。4.根据权利要求3所述纯化方法，其特征在于步骤(2)中的离心速度为2000
‑
8000rpm。5.根据权利要求4所述纯化方法，其特征在于步骤(1)硫酸软骨素a加入到猪流行性腹泻病毒液中的终浓度为0.2
‑
1.5mg/mL，硫酸葡聚糖加入到猪流行性腹泻病毒液中的终浓度为0.2
‑
1.5mg/mL。6.根据权利要求5所述纯化方法，其特征在于步骤(3)中所述解离液中含有甘露糖、甲基
‑
α
‑
D
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兰，郑其升，陈瑾，杨利，张浩明，张元鹏，程海卫，乔绪稳，侯立婷，于晓明，侯继波，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：