一种分离纯化CVB1的方法技术

本发明专利技术涉及CVB1的分离纯化方法，具体地，本发明专利技术涉及使用肝素亲和介质纯化CVB1病毒的方法。方法。方法。

【技术实现步骤摘要】
一种分离纯化CVB1的方法


[0001]本专利技术涉及CVB1的分离纯化方法，具体地，本专利技术涉及使用肝素亲和介质纯化CVB1的方法。

技术介绍

[0002]肠道病毒隶属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)，是一种无包膜的单股正链RNA病毒，病毒颗粒是直径大小约为30nm的正二十面体结构，从外到内依次为病毒衣壳和病毒核酸。肠道病毒主要包括脊髓灰质炎病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒以及新型肠道病毒。根据对乳鼠的致病性特点，柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)可分为A、B两组，A组包含23个血清型，B组有6个血清型。
[0003]柯萨奇病毒B1型(Coxsackievirus B1,CVB1)是一类常见的人类病原体，易感人群为婴幼儿，主要临床症状表现为发热、头痛、腹泻等一般感冒症状，偶发无菌性脑膜炎、心肌炎、肝炎、胰腺炎和手足口病等重症疾病，CVB1感染后的死亡率较低。
[0004]因CVB1基因组较小，可以穿透血脑屏障，同时成年人感染后引起的症状轻微等特点，作为溶瘤病毒药物具有独特的优势和较大的潜力。将CVB1开发成疫苗或治疗性药物，对纯化制备工艺有着较高的要求。首先，纯化工艺需要有效去除相关杂质，包括宿主蛋白、宿主核酸以及工艺过程添加物，如消泡剂、核酸酶等，并且，病毒的分离纯化工艺还应稳健、重复性良好，并适合商业化放大生产等。
[0005]目前关于柯萨奇病毒的分离纯化方法的文献资料报道相对较少。在这些研究中，为了获得较高纯度的柯萨奇病毒，通常采用超速离心、密度梯度离心等纯化方法，然而此类方法处理的样品量少、通量低、操作时间长，且存在病毒纯度和回收率较低等问题。

技术实现思路

[0006]本申请专利技术人经过大量研究，开发了一种基于肝素亲和介质的CVB1纯化方法，所述方法的CVB1感染滴度回收率高，杂质去除效果优异，且对初始待纯化样品要求低，纯化工艺简单，可用于大规模制备CVB1完整颗粒，且产量和纯度满足产业化要求。
[0007]因此，本申请提供了一种纯化样品中CVB1(柯萨奇病毒B1型)的方法，其包括将所述样品与肝素亲和介质相接触的步骤。
[0008]在某些实施方案中，所述方法包括对样品进行肝素亲和层析。
[0009]在某些实施方案中，所述肝素亲和层析填料使用的配基为肝素或肝素模拟物，例如Capto Heparin层析填料、
‑
65Heparin层析填料或Cellufine
TM Sulfate层析填料。
[0010]在某些实施方案中，所述Capto Heparin层析填料包括但不限于购自Cytiva的Capto Heparin层析填料。
[0011]在某些实施方案中，所述
‑
65Heparin层析填料包括但不限于购自苏州纳微的
‑
65Heparin层析填料。
[0012]在某些实施方案中，所述Cellufine
TM Sulfate层析填料包括但不限于购自JNC株式会社的Cellufine
TM Sulfate层析填料。
[0013]在某些实施方案中，所述肝素亲和层析包括以下步骤：
[0014](4)在第一溶液中，使所述样品中的CVB1与肝素亲和层析介质结合形成复合物；
[0015](5)在第二溶液中，使所述复合物解离；和，
[0016](6)收集含有CVB1的解离产物。
[0017]在某些实施方案中，所述第一溶液的电导与所述样品的电导相近，例如所述第一溶液的电导为10～15mS/cm；和/或，所述第二溶液的电导为30～50mS/cm，例如，所述第二溶液含300～500mM的NaCl。
[0018]在某些实施方案中，所述第一溶液和/或所述第二溶液的pH值与所述样品的pH值相近，例如，所述第一溶液和/或所述第二溶液的pH值为6.5～8.0。
[0019]在某些实施方案中，在步骤(1)之前，所述方法还包括调节所述样品的电导和/或pH值的步骤。
[0020]在某些实施方案中，在步骤(1)之前，所述方法还包括调节所述样品的电导至10～15mS/cm，和/或，调节所述样品的pH值至6.5～8.0。
[0021]在某些实施方案中，所述第一溶液的电导及所述样品的电导均为10～15mS/cm。
[0022]在某些实施方案中，所述第一溶液的pH值及所述样品的pH值均为6.5～8.0。
[0023]在某些实施方案中，所述第一溶液的pH值、所述第二溶液的pH值及所述样品的pH值均为6.5～8.0。
[0024]在某些实施方案中，步骤(1)中，所述肝素亲和层析的上样量为10～20个柱体积。
[0025]在某些实施方案中，所述肝素亲和层析的保留时间为10～30min。
[0026]尽管本领域已有将肝素亲和层析用于部分病毒的纯化的案例，但基于不同病毒结构的多样性，不同的病毒能否与肝素结合或者与肝素结合的特性(例如，亲和力、特异性等)千差万别。例如，本领域已明确公开野生型CVB3(柯萨奇病毒B3型)不与肝素结合，而本申请专利技术人则首次实现了将肝素亲和层析用于CVB1(柯萨奇病毒B1型)的分离纯化，且纯化效果显著。
[0027]在某些实施方案中，所述方法进一步包括对样品进行分子排阻层析，吸附层析，和/或，复合层析。
[0028]在某些实施方案中，所述方法在所述肝素亲和层析之后进一步包括对样品进行分子排阻层析，吸附层析，和/或，复合层析。
[0029]在某些实施方案中，所述吸附层析的层析介质能够吸附HCP(宿主细胞蛋白)和/或HCD(宿主细胞DNA)。
[0030]在某些实施方案中，所述复合层析的层析介质为分子筛与阴离子交换相结合的多模式复合层析介质，例如Capto Core400或Capto Core700层析介质。
[0031]在某些实施方案中，所述复合层析的层析介质为能够吸附HCP(宿主细胞蛋白)和/或HCD(宿主细胞DNA)的分子排阻层析介质。
[0032]在某些实施方案中，所述复合层析的层析介质为Capto Core400层析介质。
[0033]在某些实施方案中，所述复合层析包括以下步骤：
[0034](I)使平衡缓冲液通过所述复合层析介质；
[0035](II)使含CVB1的样品通过所述复合层析介质；
[0036](II)使顶洗缓冲液通过所述复合层析介质。
[0037]在某些实施方案中，步骤(II)中，所述样品的上样量为5～20个柱体积。
[0038]在某些实施方案中，所述复合层析的保留时间为1～10min。
[0039]在某些实施方案中，所述平衡缓冲液和/或所述顶洗缓冲液的电导与步骤(II)中的样品的电导相近，例如，所述平衡缓冲液和/或所述顶洗缓冲液的电导为10～20mS/cm。
[0040]在某些实施方案中，步骤(II)之前，所述方法还包括调节本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纯化样品中CVB1(柯萨奇病毒B1型)的方法，其包括将所述样品与肝素亲和介质相接触的步骤。2.权利要求1的方法，其中，所述方法包括对样品进行肝素亲和层析；优选地，所述肝素亲和层析填料使用的配基为肝素或肝素模拟物，例如Capto Heparin层析填料、
‑
65Heparin层析填料或Cellufine
TM
Sulfate层析填料；优选地，所述肝素亲和层析包括以下步骤：(1)在第一溶液中，使所述样品中的CVB1与肝素亲和层析介质结合形成复合物；(2)在第二溶液中，使所述复合物解离；和，(3)收集含有CVB1的解离产物；优选地，所述第一溶液的电导与所述样品的电导相近，例如所述第一溶液的电导为10～15mS/cm；和/或，所述第二溶液的电导为30～50mS/cm，例如，所述第二溶液含300～500mM的NaCl；优选地，所述第一溶液和/或所述第二溶液的pH值与所述样品的pH值相近，例如，所述第一溶液和/或所述第二溶液的pH值为6.5～8.0；优选地，在步骤(1)之前，所述方法还包括调节所述样品的电导和/或pH值的步骤；优选地，在步骤(1)之前，所述方法还包括调节所述样品的电导至10～15mS/cm，和/或，调节所述样品的pH值至6.5～8.0；优选地，步骤(1)中，所述肝素亲和层析的上样量为10～20个柱体积；优选地，所述肝素亲和层析的保留时间为10～30min。3.权利要求2的方法，其中，所述方法进一步包括对样品进行分子排阻层析，吸附层析，和/或，复合层析；优选地，所述方法在所述肝素亲和层析之后进一步包括对样品进行分子排阻层析，吸附层析，和/或，复合层析。4.权利要求3的方法，其中，所述吸附层析的层析介质能够吸附HCP(宿主细胞蛋白)和/或HCD(宿主细胞DNA)；优选地，所述复合层析的层析介质为分子筛与阴离子交换相结合的多模式复合层析介质，例如Capto Core400或Capto Core700层析介质。5.权利要求4的方法，其中，所述复合层析包括以下步骤：(I)使平衡缓冲液通过所述复合层析介质；(II)使含CVB1的样品通过所述复合层析介质；(II)使顶洗缓冲液通过所述复合层析介质；优选地，步骤(II)中，所述样品的上样量为5～20个柱体积；优选地，所述复合层析的保留时间为1～10min；优选地，所述平衡缓冲液和/或所述顶洗缓冲液的电导与步骤(II)中的样品的电导相近，例如，所述平衡缓冲液和/或所述顶洗缓冲液的电导为10～20mS/cm；优选地，步骤(II)之前，所述方法还包括调节所述样品的电导至10～20mS/cm；优选地，所述平衡缓冲液与所述顶洗缓冲液相同或接近；优选地，所述复合层析的层析柱的柱高为10～30cm。6.权利要求1～5任一项的方法，其中，所述样品为含有宿主细胞成分的病毒培养物，并
且，所述方法在进行层析之前还包括对样品进行预处理，所述预处理包括裂解细胞释放CVB1的步骤；优选地，所述预处理包括步骤：(i)裂...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨立生，刘冰，丁天宇，冀成法，王利敏，施炜，
申请(专利权)人：杭州养生堂生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：