用于修饰抗体以制备免疫缀合物的特定位点制造技术

本申请提供了用于通过将亲本抗体或抗体片段的恒定区中的至少一个天然氨基酸替换为半胱氨酸来修饰抗体或抗体片段的特定位点，所述位点可以用作接合有效载荷或接头‑有效载荷组合的位点。在一个实施方案中，用半胱氨酸在如EU编号样式所定义的重链恒定区位置152和375处修饰抗体。在另一个实施方案中，用半胱氨酸在如EU编号样式所定义的重链恒定区位置360和κ轻链恒定区位置107处修饰抗体。

Specific site for modifying antibodies to produce an immune conjugate

This application provides for the at least one natural amino acid constant parental antibodies or antibody fragments in specific sites for cysteine modified to replace antibodies or antibody fragments, the site can be used as a joint payload or joint payload combination site. In one embodiment, the antibodies are modified with cysteine at a constant chain position 152 and 375 defined by the EU numbering pattern. In another embodiment, an antibody is modified with cysteine at a constant position 360 and a constant position of the light chain of the light chain, as defined by the EU numbering pattern, at the location of a region of 107.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
归因于抗体对于多种治疗性应用的重要性，需要选择性修饰抗体的稳健的方法以引入改善的特性或额外的功能。本申请公开了特定位点用于部分与抗体接合以产生修饰的抗体，如用于制备抗体-药物缀合物(ADC)。选择性缀合位点位于抗体的恒定区上并且因此可用于多种抗体。背景用于修饰抗体的方法的价值是熟知的，并且已经开发了用于缀合抗体以接合多种“有效载荷(payload)”部分的许多方法。这些方法中许多依赖于抗体上天然存在的可以用来接合有效载荷的特定反应性氨基酸残基，如赖氨酸和半胱氨酸。然而，依赖于天然氨基酸并不总是合乎需要，因为连接的有效载荷的位置和量取决于那些反应性氨基酸的数目和位置：过多或过少的这类残基导致难以有效控制有效载荷负载到抗体上。此外，反应性氨基酸的安置可能使其难以获得完整缀合，在缀合期间导致不均一产物。例如，药物有效成分的不均一性一般是不利的，因为它加重了向异质的受试者群体施用药物的不可预测性：十分优选施用均质产物，并且充分表征及预测不均一产品的行为是非常困难的。细胞毒药物通过例如工程化的半胱氨酸残基与抗体的位点特异性缀合导致显示出改善治疗指数的均一免疫缀合物(Junutula等人,(2008)NatBiotechnol.26(8):925-932))。已经工程化抗体以在特定位置中添加某些残基如半胱氨酸，其中这些残基可以用于缀合(Lyons等人,(1990)ProteinEng.,3:703-708)，但是特定置换的值可能随某些抗体而变动，因为工程化的半胱氨酸可能干扰抗体的折叠及正确分子内二硫键的氧化(Voynov等人,(2010)Bioconjug.Chem.21(2):385-392)。因为抗体生物合成期间通过二硫键用谷胱甘肽(GSH)和/或半胱氨酸修饰哺乳动物细胞中表达的抗体中的工程化半胱氨酸(Chen等人(2009)mAbs1:6,563-571)，如初始表达的抗体药物缀合物产物中的修饰半胱氨酸对巯基反应性试剂无反应。工程化半胱氨酸的激活需要还原GSH和/或半胱氨酸加合物(其一般导致抗体的全部链间二硫键还原)，随后在缀合之前天然链间二硫键的再氧化和重新形成(Junutula等人,(2008)Nat.Biotechnol.26(8):925-32)。一些其中已经插入半胱氨酸的位点干扰了再氧化过程并随后产生不利的、非均质的缀合产物。因此重要的是鉴定抗体上引入半胱氨酸的位点不干扰在与硫醇反应性试剂如马来酰亚胺或溴乙酰胺、氯乙酰胺或碘乙酰胺基团缀合之前的再次氧化过程。半胱氨酸残基与溴乙酰胺、碘乙酰胺或氯乙酰胺的缀合导致稳定硫醚键的形成。(Alley等人,(2008)BioconjugChem.19(3):759-65)。然而，这种化学比马来酰亚胺缀合化学更低效。由于形成这类巯基-马来酰亚胺键是在接合有效载荷或接头至半胱氨酸时使用的流行和高度有效的方法，所以需要鉴定在抗体上可以使用马来酰亚胺键的半胱氨酸置换位点。更重要地，位点特异性缀合的免疫缀合物可以显示改善的治疗指数，因此依旧需要鉴定抗体中用于半胱氨酸置换的专用位点，所述专用位点能够使有效载荷到抗体上的缀合过程高效地形成，并且提供具有高稳定性的缀合物。本申请为缀合目的提供产生改善的抗体的这类专用半胱氨酸置换位点以及包含这类改善的抗体的免疫缀合物。专利技术概述本申请提供在抗体或抗体片段的恒定区中的特定位点，在所述位点，可以进行半胱氨酸(“Cys”)替换亲本抗体或抗体片段上的天然氨基酸，旨在提供Cys残基用于接合化学部分(例如，有效载荷/药物部分)以形成具有良好效率和稳定性的免疫缀合物。本申请进一步提供在一个或多个这些特定位点中具有一个或多个Cys残基的工程化抗体或抗体片段，以及由这类工程化抗体或抗体片段制成的免疫缀合物。在抗体的特定位置处插入Cys的方法是本领域已知的，参见，例如，WO2011/005481。但是，本申请公开了在抗体或抗体片段的恒定区中的特定位点，其中用Cys替换亲本抗体或抗体片段的一个或多个天然氨基酸提供了以下一个或多个优点：促进高效免疫缀合的良好反应性；当使用Cys-马来酰亚胺缀合接头时有效载荷丢失的倾向降低；形成不利二硫键如抗体之间交联或形成非天然分子内二硫键的倾向降低；和所产生的ADC的疏水性低。选择特定专用位点以便Cys替换亲本抗体或抗体片段恒定区中的天然氨基酸，以提供有效缀合，同时使不利影响最小化。首先，选择用于修饰的特定位点，从而在一个或多个选择的位置中用Cys替换亲本抗体或抗体片段的天然氨基酸提供了在新半胱氨酸上轻易缀合的抗体或抗体片段。选择表面充分可及的特定位置以允许半胱氨酸残基的硫氢基对水溶液中的亲电体有反应性。鉴定合适位点用于Cys替换亲本抗体或抗体片段的天然氨基酸涉及基于晶体结构数据分析天然氨基酸的表面暴露。因为本文所述的位点是充分可及和反应的，所以借助本领域熟知用于修饰天然存在的半胱氨酸残基的化学，它们可以用来形成免疫缀合物。Cys替换残基的缀合因此使用常规方法。当缀合中使用巯基-马来酰亚胺部分时，选择的修饰位点可以显示低的缀合逆转倾向性。巯基-马来酰亚胺缀合反应经常具有高度选择性并且极端有效的，并且可以用来接合有效载荷至蛋白质的半胱氨酸残基的巯基或作为蛋白质和有效载荷之间的键接中的其他地方的接头。例如，马来酰亚胺可以与蛋白质(例如，抗体或抗体片段)接合，并且可以添加具有接合的巯基的有效载荷至马来酰亚胺以形成缀合物。因此，在这个缀合步骤中，蛋白质(例如，抗体或抗体片段)可以是单圈或双圈；另一个代表有效载荷。免疫缀合物稳定性信息在此特别地涉及通过与马来酰亚胺基反应而缀合置换的半胱氨酸。在一些实施方案中，巯基来自蛋白质(例如，抗体或抗体片段)上的半胱氨酸，因而双圈代表蛋白质并且单圈代表有效载荷。尽管巯基-马来酰亚胺反应经常用于产生缀合物，但是如下文所述的缀合步骤逆转可能导致有效载荷丢失或其他含巯基的种类弄乱了有效载荷。已经报道，一些半胱氨酸置换位点比其他位点提供更稳定的马来酰亚胺缀合物，假定地认为是因为抗体表面上新半胱氨酸周围的某些点处的局部化学环境可以促进琥珀酰亚胺环水解并因此防止免疫缀合物中的巯基-马来酰亚胺键逆转(Shen等人,(2012),Nat.Biotechnol.30(2):184-9)。鉴定有利位点以符合这种标准涉及插入Cys替换许多具有合适表面暴露的天然氨基酸，产生含有巯基-马来酰亚胺键的免疫缀合物，并且评估免疫缀合物的稳定性，以消除其中缀合物的稳定性因去稳定化位点周围的局部微环境而降低的位点。因此，可以用来接合接头和有效载荷至Cys替换残基的化学不受与上文讨论的巯基-马来酰亚胺缀合物可逆性相关的稳定性问题限制。众多方法可以用来在半胱氨酸处形成缀合物，包括马来酰亚胺缀合法。当使用最常见的缀合方法之一时，本文所述的用于半胱氨酸置换的位点促进抗体缀合物产物的稳定性，使得这些位点有利于抗体工程化，因为修饰的抗体可以随熟知和高度有效的马来酰亚胺缀合法一起使用。选择的位点可以如此安置，从而最大限度减少可能干扰均匀缀合物形成的不利二硫键形成。当含有工程化半胱氨酸的抗体或抗体片段在哺乳动物细胞中产生时，Cys残基一般相对于游离Cys氨基酸或谷胱甘肽作为二硫键存在(Chen等人,(2009)本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含修饰的抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述修饰的抗体或抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸置换两个或多个氨基酸的组合，其中组合包含选自抗体重链的位置360和抗体κ轻链的位置107的置换，其中所述位置根据EU系统编号。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.12 US 61/952,0261.包含修饰的抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述修饰的抗体或抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸置换两个或多个氨基酸的组合，其中组合包含选自抗体重链的位置360和抗体κ轻链的位置107的置换，其中所述位置根据EU系统编号。2.包含修饰的抗体或其抗体片段的免疫缀合物，其中所述修饰的抗体或抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸置换两个或多个氨基酸的组合，其中组合包含选自抗体重链的位置152和375的置换，其中所述位置根据EU系统编号。3.包含修饰的抗体或其抗体片段的免疫缀合物，所述修饰的抗体或其抗体片段包含SEQIDNO:48的重链恒定区和包含SEQIDNO:61的κ轻链恒定区。4.包含修饰的抗体或其抗体片段的免疫缀合物，所述修饰的抗体或其抗体片段包含SEQIDNO:131的重链恒定区。5.根据权利要求1-4中任一项所述的免疫缀合物，其中免疫缀合物还包含药物部分。6.根据权利要求1-5中任一项所述的免疫缀合物，其中药物/抗体比是约4。7.根据权利要求1-6中任一项所述的免疫缀合物，其中所述药物部分通过所述半胱氨酸的硫和任选的接头与修饰的抗体或抗体片段连接。8.根据权利要求7所述的免疫缀合物，其中所述药物部分通过可切割的或不可切割的接头与所述半胱氨酸的所述硫连接。9.根据权利要求8所述的免疫缀合物，其中所述药物部分通过不可切割的接头与所述半胱氨酸的所述硫连接。10.根据权利要求7-9所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含巯基-马来酰亚胺键。11.根据权利要求10所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含–S-CH2-C(＝O)-键或二硫键。12.根据权利要求11所述的免疫缀合物，其中所述药物部分是细胞毒性剂。13.根据权利要求12所述的免疫缀合物，其中所述药物部分选自紫杉烷类、DNA烷化剂(例如，CC-1065类似物)、蒽环类、微管溶素类似物、倍癌霉素类似物、澳瑞司他汀E、澳瑞司他汀F、类美登素和Eg5抑制剂。14.根据权利要求1-13中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体是单克隆抗体。15.根据权利要求1-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·H·盖尔斯坦格尔，W·欧，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH