本发明专利技术提供一种重组载体、利用该载体制备的重组杆状病毒以及该病毒在疟疾疫苗制备中的应用。该重组载体由一段重组序列插入到pFastBacDual载体中构建而成，所述重组序列为根据CMV、Ph、SP、TM序列，在SP和TM间加入EcoR I酶切位点和Xho I酶切位点，CMV-F前加入KpnI酶切位点，TM-R后加入HindIII酶切位点形成。该重组杆状病毒由约氏疟原虫Pys25抗原基因插入到该重组载体并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，然后转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到。该重组杆状病毒通过简单地分离纯化，制备抗体具有良好的效价，能够为P25疟疾疫苗的研究提供参考。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种经改造的杆状病毒载体即重组载体，利用该载体制备的含目的基因(约氏疟原虫表面蛋白PyS25基因)的重组杆状病毒，该重组杆状病毒的制备方法，该重组杆状病毒表达的融合蛋白，以及该重组杆状病毒和该融合蛋白在痕疾疫苗制备中的应用。
技术介绍
由媒介蚊虫传播的疟疾是一种严重威胁人类生命健康的感染性疾病。据2011年WH0《2011年世界疟疾报告》指出，2010年，在全球106个疟疾流行国家及地区共发现约2.16亿病历，其中86%的疟疾病历是5岁以下儿童。据估计，在2010年，全球共有超过65万例疟疾死亡病历。疟疾疫苗的研制和开发是控制疟疾传播的重要策略之一，且随着越来越多的疟原虫耐药株被发现，疟疾疫苗的研制显得尤为重要。约氏疟原虫表面蛋白Pys25是其有性生殖阶段动合子时期的表面蛋白，其结构高度保守，并和其他疟原虫的P25蛋白有较高的同源性，常被用作实验室建立模型为其他疟疾的研究提供参考。目前世界上常用大肠杆菌和酵母表达蛋白制备疫苗，而用大肠杆菌表达的蛋白大多数无免疫原性和保护性，酵母表达制备的疫苗效果也不是很理想。哺乳细胞表达系统(CHO)等表达系统虽然效果好，但因表达量低，同时需大量培养基和牛血清蛋白，成本高，不适合生产需要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种重组杆状病毒载体，利用该载体构建表面展示约氏疟原虫Pys25抗原的重组杆状病毒，通过简单地分离纯化病毒粒子，制备抗体具有良好的抗体效价，能够为P25痕疾疫苗的研究提供参考。本专利技术所采用的技术方案为:一种重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM,该重组载体由一段重组序列插入到pFastBacDual载体中构建而成,所述重组序列为根据CMV、Ph、SP、TM已知序列,在SP和TM核苷酸序列间加入EcoR I酶切位点和Xho I酶切位点，CMV-F前加入KpnI酶切位点，TM-R后加入HindIII酶切位点形成，所述重组序列全长为923bp，如SEQ ID NO:1所示。具体地,所述重组序列插入到pFastBacDual载体的KpnI酶切位点和HindIII酶切位点之间。本专利技术进一步提供利用上述重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM构建的重组杆状病毒BmPys25，该重组杆状病毒由约氏疟原虫Pys25抗原基因插入到重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到表面展示有约氏疟原虫Pys25抗原的重组杆状病毒。具体地，所述约氏疟原虫Pys25抗原基因插入到重组载体PFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM的EcoR I酶切位点和Xho I酶切位点之间。具体地，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。穿梭载体Bacmid (即Baculovirusplasmid)为带有杆状病毒基因组的质粒,可在细菌和昆虫细胞之间穿梭，是Bac-to-bac杆状病毒表达系统的成员之一，该系统还包括供体质粒和辅助质粒及大肠杆菌，为现有技术。载体pFastBacDual是Bac_to_bac表达系统的供体质粒,可以插入外源基因并在辅助质粒编码的转座酶作用下，将外源基因插入到Bacmid中。载体pFastBacDual已经商品化;CMV启动子为哺乳动物启动子，将其插入杆状病毒后，杆状病毒可以在哺乳动物里表达外源基因。上述重组杆状病毒BmPys25的制备方法，包括以下步骤:(I)通过PCR扩增的方法得到约氏疟原虫Pys25抗原基因，然后将约氏疟原虫Pys25抗原基因连接到重组载体pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM的EcoR I酶切位点和Xho I酶切位点之间，得到重组转座质粒pFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys25-TM ；(2)将重组转座质粒PFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys25-TM转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，进行同源重组，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板上进行蓝白斑筛选，避光培养40_48h后挑取白斑，白斑继续培养24-48h后抽提重组杆状病毒基因组DNA进行PCR鉴定；(3)取步骤(2)鉴定正确的重组杆状病毒基因组DNA通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，鉴定正确的即为表面展示约氏疟原虫Pys25抗原的重组杆状病毒BmPys25。上述重组杆状病毒BmPys25所表达的融合蛋白SP-Pys25_TM，由约氏疟原虫Pys25蛋白的N端接gp64分泌性信号肽(SP)、C端接gp64跨膜结构域(TM)构成,其氨基酸序列如 SEQ ID NO:10 所示。本专利技术进一步提供上述重组杆状病毒BmPys25在疟疾疫苗制备中的应用。本专利技术还进一步提供上述重组杆状病毒BmPys25表达的融合蛋白SP-Pys25_TM在疟疾疫苗制备中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下显著优点和有益效果:(I)本专利技术通过分析约氏疟原虫Pys25基因，发现其编码217个氨基酸，其两端为疏水区，中间段为亲水区，且其N-端含有20个氨基酸残基的信号肽，Pys25蛋白第177至192氨基酸残基为EGF-1ike结构域(CdCkdGFklsveeekC)如SEQ ID NO:9所示，表明其具有表皮生长因子等相关功能，同时BLAST分析表明，其与其他疟疾的P25蛋白有很高的同源性，因此可以作为一种模型用于其他疟疾的研究。(2)本专利技术将约氏疟原虫Pys25蛋白基因与家蚕杆状病毒囊膜蛋白gp64基因融合，家蚕杆状病毒囊膜蛋白gp64含有两个高度疏水区:N-末端的分泌性信号肽(SP)和C-末端的跨膜结构域(TM)，与跨膜结构域相连的是亲水性结构域，可以把病毒囊膜与宿主细胞膜内的糖蛋白连接在一起，从而使本专利技术实现了目的Pys25蛋白在病毒衣壳上的表面展示。(3)本专利技术构建的表面展示约氏疟原虫Pys25蛋白的重组杆状病毒，可以利用家蚕BmN细胞作为生物反应器，通过家蚕杆状病毒表达系统高效表达约氏疟原虫Pys25蛋白，其可以制备疫苗，为其他疟疾的研究提供参考。家蚕生物反应器作为一种真核表达系统，适用于大规模生产，成本低，产量高，所生产的疫苗应用价值大。(4)目前Pys25疫苗尚无利用杆状病毒表面展示技术生产，家蚕杆状病毒表达系统是真核表达，具有翻译后修饰功能，能使表达的蛋白其结构更接近于其天然构象，通过简单地分离纯化病毒粒子，免疫Balb/c小鼠，获得的抗体具有良好的抗体效价。【附图说明】图1所示的是载体pFastBacDual的结构示意图。图2所示的是重组转座质粒pFstBacDual-CMV-Ph-SP-Pys25_TM的构建图，其中CMV:哺乳动物启动子；Ph:多角体启动子；SP:gp64基因的信号肽序列；Pys25蛋白:约氏疟原虫动合子时期表面蛋白；TM:gp64基因的跨膜区序列；Kpn 1、EcoR 1、Xho 1、Hind III:酶切位点。图3所示的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组载体pFastBacDual‑CMV‑Ph‑SP‑TM，其特征在于：由一段重组序列插入到pFastBacDual载体中构建而成，所述重组序列为根据CMV、Ph、SP、TM已知序列，在SP和TM核苷酸序列间加入EcoR I酶切位点和Xho I酶切位点，CMV‑F前加入KpnI酶切位点，TM‑R后加入HindIII酶切位点形成，所述重组序列全长为923bp，如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张耀洲，李伟杰，崔立旺，王小飞，闫晶晶，舒特俊，陈剑清，盖其静，
申请(专利权)人：特菲天津生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
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