含SARS病毒N抗原的重组蛋白及展示N蛋白的杆状病毒制造技术

本发明专利技术公开了含SARS病毒N抗原的重组蛋白及展示N蛋白的杆状病毒，该重组蛋白SP-N-TM是由SARS病毒的N蛋白的N-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的信号肽SP，C-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM构成。表面展示SARS抗原N蛋白的重组杆状病毒是由SP-N-TM的编码基因插入到供体质粒并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组，然后将重组杆状病毒基因组转染家蚕细胞，在其内包装得到的重组杆状病毒。本发明专利技术的重组杆状病毒将SARS病毒的N蛋白基因与家蚕杆状病毒囊膜蛋白GP64基因融合，实现N蛋白在病毒衣壳上的表面展示，具有良好的免疫原性，应用价值大。

【技术实现步骤摘要】
含SARS病毒N抗原的重组蛋白及展示N蛋白的杆状病毒
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种含SARS病毒N抗原的重组蛋白，及展示N蛋白的重组杆状病毒。
技术介绍
严重急性呼吸综合征（SevereAcuteRespiratorySyndromes），又称传染性非典型肺炎，简称SARS，是一种因感染SARS冠状病毒引起的新的呼吸系统传染性疾病。主要通过近距离空气飞沫传播，以发热、头痛、肌肉酸痛、乏力、干咳少痰等为主要临床表现，严重者可出现呼吸窘迫。本病具有较强的传染性，在家庭和医院有显著的聚集现象。首发病例，也是全球首例，于2002年11月出现在广东佛山，并迅速形成流行态势。2002年11月至2003年8月5日，29个国家报告临床诊断病例共8422例，死亡916例。报告病例的平均死亡率为9.3%。该病毒很可能来源于动物，由于外界环境的改变和病毒适应性的增加而跨越种系屏障传染给人类，并实现了人与人之间的传播。虽然SARS已被控制，但SARS病毒不大可能在短期内被“消灭”或自动消失，SARS在人群中再次出现的可能性很大。再次发生SARS疫情的时间，主要与病毒侵袭人体的时间有关，不一定表现为冬春高发。动物携带病毒的季节性分布、人接触感染动物的机会等都将影响再次发生疫情的时间。动物仍然是病毒的可能来源，人群对SARS病毒仍然普遍易感，其疫苗仍是目前的研究重点。目前SARS疫苗包括治疗性疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗、多表位疫苗等，已有一定进展，但也存在相应的问题，具体见下表。表1优点缺点治疗性疫苗不需宿主识别抗体的Fc段需要抗体人源化灭活病毒疫苗时间短；廉价；技术较易；疫苗相对稳定；不需要冷藏；易于运输生产安全条件极高；存在安全性问题；需多次注射；免疫应答效果微弱核酸疫苗（基因疫苗或DNA疫苗）制备简单；易大量生产；安全性好，可同时诱导体液免疫和细胞免疫应答；可在体内持续表达持续表达外源可能产生一些不良后果；影响核酸疫苗诱发机体免疫应答的不确定因素很多多表位疫苗可以和不同类型的MHC分子结合，实现高效提呈，并且可诱导很强的细胞免疫缺乏对SARS-CoV蛋白抗原表位，特别是构象表位的深入了解；合成的多肽仅能覆盖少数的线性抗原表位，不可能诱导产生高水平的体液免疫应答亟待研究一种新的SARS疫苗克服上述问题。
技术实现思路
为了克服现有技术疫苗的上述缺陷，本专利技术提供了一种含SARS病毒N抗原的重组蛋白SP-N-TM，利用该重组蛋白构建表面展示SARS抗原N蛋白的重组杆状病毒，具有良好的免疫原性。该含SARS病毒N抗原的重组蛋白SP-N-TM，是由SARS病毒的N蛋白的N-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的信号肽SP，C-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM构成。优选地，上述含SARS病毒N抗原的重组蛋白SP-N-TM，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术还提供了上述含SARS病毒N抗原的重组蛋白SP-N-TM的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供了一种表面展示SARS抗原N蛋白的重组杆状病毒，是由上述重组蛋白SP-N-TM的编码基因插入到供体质粒并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到所述的表面展示SARS抗原N蛋白的重组杆状病毒。穿梭载体Bacmid（即Baculovirusplasmid）为带有杆状病毒基因组的质粒，可在细菌和昆虫细胞之间穿梭，是Bac-to-bac杆状病毒表达系统的成员之一，该系统还包括供体质粒和辅助质粒及大肠杆菌，均为现有技术。优选地，上述表面展示SARS抗原N蛋白的重组杆状病毒，所述供体质粒为pFastBacDual，重组蛋白SP-N-TM的编码基因插入到供体质粒pFastBacDual的p10启动子下，构建成重组转座质粒后再与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组。其中，载体pFastBacDual是Bac-to-bac表达系统的供体质粒，可以插入外源基因并在辅助质粒编码的转座酶作用下，将外源基因插入到Bacmid中。载体pFastBacDual已经商品化。优选地，上述表面展示SARS抗原N蛋白的重组杆状病毒，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。本专利技术还提供了上述表面展示SARS抗原N蛋白的重组杆状病毒的制备方法，步骤如下：（1）PCR扩增获得杆状病毒囊膜蛋白GP64信号肽SP的编码基因、SARS病毒的N蛋白的编码基因和杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的编码基因；（2）通过重叠PCR扩增的方法拼接步骤（1）获得的三种基因序列，得到重组蛋白SP-N-TM的编码基因，再将编码基因片段连接到载体pFastBacDual的p10启动子下，构建成重组转座质粒；（3）重组转座质粒转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，进行同源重组，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板上进行蓝白斑筛选，避光培养40~48h后挑取白斑，白斑继续培养24~48h后抽提重组杆状病毒基因组DNA进行PCR鉴定；（4）取步骤（3）鉴定正确的重组杆状病毒基因组DNA通过脂质体介导法转染家蚕细胞，发病后获得一代病毒悬液，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，鉴定正确的即为表面展示SARS抗原N蛋白的重组杆状病毒；所述PCR鉴定使用如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:9所示的引物序列。优选地，上述表面展示SARS抗原N蛋白的重组杆状病毒的制备方法，步骤（1）中扩增杆状病毒囊膜蛋白GP64信号肽SP的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQIDNO:4~5所示；扩增SARS病毒N蛋白的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQIDNO:6~7所示；扩增杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的编码基因使用的引物核苷酸序列如SEQIDNO:8~9所示。本专利技术还提供了上述表面展示SARS抗原N蛋白的重组杆状病毒在制备SARS疫苗中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：通过分析SARS病毒的基因组结构，发现N蛋白含422个氨基酸，以与RNA结合的形式存在于病毒颗粒的核心部分，参与病毒的转录与复制，比其他蛋白如S、M等保守。N蛋白的N末端存在一高度保守的序列FYYLGTGP（SEQIDNO:10），这一序列在所有其他冠状病毒N蛋白中均有存在。因此成功的N基因疫苗能诱导产生强的、广谱的、持久的中和抗体和保护性的T细胞免疫应答。家蚕杆状病毒囊膜蛋白GP64含有两个高度疏水区：N-末端的分泌性信号肽（SP）和C-末端的跨膜结构域(TM)，与跨膜结构域相连的是亲水性结构域，可以把病毒囊膜与宿主细胞膜内的糖蛋白连接在一起。本专利技术将SARS病毒的N蛋白基因与家蚕杆状病毒囊膜蛋白GP64基因融合，实现目的N蛋白在病毒衣壳上的表面展示。本专利技术构建的表面展示SARS抗原N蛋白的重组杆状病毒，可以利用家蚕BmN细胞作为生物反应器，通过家蚕杆状病毒表达系统高效表达具有极高临床应用价值的SARS病毒的N蛋白，其可以制备疫苗，也可以直接用重组病毒制备疫苗，适用于大规模生产，可降低成本，提高产量，所生产的SARS疫苗应用价值大。SARS疫苗尚无利用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含SARS病毒N抗原的重组蛋白SP‑N‑TM，其特征在于，该蛋白是由SARS病毒的N蛋白的N‑端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的信号肽SP，C‑端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM构成。

【技术特征摘要】
1.一种含SARS病毒N抗原的重组蛋白SP-N-TM，其特征在于，该蛋白是由SARS病毒的N蛋白的N-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的信号肽SP，C-端连接杆状病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM构成；所述重组蛋白SP-N-TM的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.权利要求1所述的含SARS病毒N抗原的重组蛋白SP-N-TM的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。3.一种表面展示SARS抗原N蛋白的重组杆状病毒，其特征在于，该病毒是由权利要求2所述重组蛋白SP-N-TM的编码基因插入到供体质粒并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到所述的表面展示SARS抗原N蛋白的重组杆状病毒。4.根据权利要求3所述的表面展示SARS抗原N蛋白的重组杆状病毒，其特征在于，所述供体质粒为pFastBacDual，重组蛋白SP-N-TM的编码基因插入到供体质粒pFastBacDual的p10启动子下，构建成重组转座质粒后再与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组。5.根据权利要求4所述的表面展示SARS抗原N蛋白的重组杆状病毒，其特征在于，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。6.权利要求3~5任一所述的表面展示SARS抗原N蛋白的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）PCR扩增获得杆状病毒囊膜蛋白GP64信号肽SP的编码基因、SARS病毒的N蛋白的编码基因和...

【专利技术属性】
技术研发人员：张耀洲，闫晶晶，舒特俊，陈剑清，盖其静，
申请(专利权)人：特菲天津生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12