杆状病毒载体制造技术

本发明专利技术涉及用于将基因插入到杆状病毒序列的基因座中的转移载体。所述转移载体包括表达框，该表达框包括与基因可操作地连接的真核启动子，和双向选择框。本发明专利技术还涉及使用该转移载体及衍生的杆粒和杆状病毒的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】杆状病毒载体本专利技术涉及用于将基因插入到杆状病毒序列的基因座中的转移载体。本专利技术还涉及使用转移载体和衍生的杆粒和杆状病毒的方法。已经将杆状病毒表达系统用于在真核细胞中表达数以千计的蛋白质用于结构和生物化学研究(14)。除了表达单个重组蛋白的能力之外，杆状病毒系统也已用于共同表达形成复合物的多种蛋白(15-22)。这一点是重要的，因为基因组范围内的相互作用的筛选揭示了活细胞的多种关键功能是由多亚基蛋白复合物完成的(23)。已经使用了两种主要的策略利用杆状病毒系统实现蛋白质的共表达。使用各自表达一种重组蛋白的两种或者多种病毒共感染细胞是目前为止最常见的方法(19，24，25)。然而，这些研究中蛋白质复合物的产率通常变化很大并且由两种不同的杆状病毒共感染相同的细胞不满足泊松分布(poisson distribution) (26)。因此，尽管共感染方法在技术上简单，但在实践中其仅限于相对简单的复合物的回收，用于不需要大量纯化蛋白的应用。对于例如结构研究和需要多种蛋白质的大规模的疫苗试验的应用而言，以及对于由多个亚基形成的更加复杂的复合物而言，使用了共表达来自插入到多角体蛋白或者PlO 位置的多个类似表达框中的的蛋白质的可选方法(15-18，22，27)。该方法的优点在于在培养物中的每一个被重组病毒感染的细胞都以可再生的方式表达形成蛋白质复合物所需要的蛋白质。将共感染和单独杆状病毒方法进行比较时，单独杆状病毒方法证明具有显著更高的重组复合物产率(28)。然而，使用单独的重组病毒表达多种蛋白质并不是没有缺点。 尽管棒状的杆状病毒看起来似乎对于其基因组中的插入相当有耐受力，但基因是通过同源重组转移到病毒，同时转移载体的尺寸必须容易在大肠杆菌中操作。因此，对于能插入到转移载体中的基因的数目有限制。在实践中，这意味着不大可能表达来自单个座位上的多于4 种的蛋白质。除此之外，杆状病毒含有表达蛋白质的序列，该蛋白质促进同源重组(29-32)。 因此，含有大量重复序列的病毒容易发生重排和重组(21，33，34)。通过在杆粒的chiA/cath印sin基因座插入IoxP位点，修改了单独杆状病毒共表达的方法，所述的杆粒已经在多角体蛋白基因座上含有Tn7的靶点(20)。这使得通过在大肠杆菌中的重组在这些基因座的每一个中插入多个表达框。正如假定这个系统依赖于经过修饰以表达不同基因的表达框的重复复制所预料的那样，有证据显示插入到该系统中在某种程度上在遗传上不稳定(21)。最近的杆状病毒研究受益于ET重组系统的使用，该重组系统使得能够选择性地敲除病毒的基因(35-49)。然而，还未检验这种技术改造和促进在PlO和多角体蛋白之外的基因座上表达蛋白的潜力。本专利技术涉及从单个的杆状病毒基因组中有效地表达多种重组蛋白质(即杆状病毒蛋白质)的方法。该方法使得能够使用ET重组系统在病毒基因组内的不同基因座上有效地插入单个的蛋白质表达框。除此之外，该方法使得能表达具有多个亚基的复合物。已经完善地建立了使用杆状病毒作为表达系统来表达单个的蛋白质。该表达系统的基本方法学自从其首次产生以来变化很小。到133kb时杆状病毒的dsDNA太大无法直接操作。因此将编码外来蛋白质的基因在大肠杆菌中克隆到含有来自AcMNPV昆虫病毒的表达框的载体中，随后将其与病毒DNA —起引入到昆虫细胞中，在昆虫细胞中病毒和细胞的蛋白质介导同源重组，导致表达外源蛋白质的感染性(相对于昆虫细胞)病毒的产生。在这一主旨下，已经产生了一些变化，包括如果发生重组仅仅复制的病毒基因组(1，2)，和在大肠杆菌中使用杆粒进行重组从而加快重组病毒的选择，所述的杆粒基于转位子Tn7(3)的使用。通过使用以上简述的杆状病毒表达系统，还实现了多蛋白复合体在昆虫细胞中的表达。最初使用各自表达单一蛋白质的多种病毒共感染易感细胞和在表达之后纯化的蛋白质复合物。然而，这充其量也没有效力并且重复性不足以用于扩大规模。作为选择，生产了将多个表达单元整合但是与单个的病毒基因座重组的载体(4-6)。这些载体的优点在于它们在每一个受感染的细胞中生产全部的重组蛋白亚基，并导致显著更高的重组蛋白复合物的产率。除此之外，由于仅有一种病毒表达所有的蛋白，感染的结果更加具有可重复性。这些载体的缺点是双重的。首先，该载体含有重复的序列，并且所述的杆状病毒表达促进同源组合、表达的蛋白质，尤其是来自含有三个或者四个表达单元的蛋白质，并且所述的蛋白质通过大量的病毒传代(其在工业规模中对于杆状病毒蛋白质表达是必要的)并不总是在遗传上非常稳定。第二，实践中对于可以在大肠杆菌中容易保持和操作的插入物的大小有限制， 限制了可以从这些载体中表达的蛋白质的数目。为了生产多种蛋白质，提出的另一种方法是在杆状病毒的一个基因座上插入外来蛋白质，随后选择表达该蛋白的病毒，并使用该病毒基因组在第二个基因座上重组，从而表达其他的蛋白质(7)。然而，由于在此方法中涉及的高水平的技术技能和时间的量(第一个座位16天以及各个随后的座位各25天)，这种方法基本未曾使用。最近的开发旨在修饰基于BAC的Τη7转位子，以便在杆状病毒的第二个基因座中插入LoxP位点，从而使得能在大肠杆菌中的该座位上插入额外的基因(8)。然而， 本方法仍然存在下述问题，即在细菌载体中来自启动子的复制的重复序列意味着对于多个病毒传代而言，该构建物在遗传上不稳定，并且转移载体会迅速地达到在大肠杆菌中操作的最大实际尺寸。本专利技术的方法克服了现有方法中固有的至少一些问题，例如遗传不稳定性，以及对多轮重组的需要。根据第一个方面，本专利技术提供了用于将基因插入到杆状病毒序列的基因座中的转移载体，该转移载体包括表达框，所述表达框包括与基因可操作地连接的真核启动子；双向选择框，该双向选择框包括(i)编码第一个选择标记的可表达序列；和(ii)编码第二个选择标记的可表达序列；和位于表达和双向选择框侧翼的序列，其中所述的序列大体上对应于杆状病毒序列中基因座的序列。本专利技术的转移载体可以用于将基因有效地插入到杆状病毒序列的基因座中，并选择包含该基因的杆状病毒序列。特别地，已经发现，与使用单个选择标记相比，通过使用双向选择框，阳性克隆(即含有所插入的基因的杆状病毒序列)的鉴定获得了大幅度增加。这与使用单个的选择标记相比，具有显著优势。仅有少量的杆状病毒被转化，所以标记仅仅以很低的水平表达。例如，如果该标记具有抗生素抗性，则只能使用非常低水平的抗生素。这导致了对细菌变体的选择，该细菌变体对于所使用的抗生素具有抗性。因此，一些在平板上生长的细菌可以不含有修饰。使用两种阳性选择方法克服该假阳性的选择。本专利技术的转移载体可以是任意适用的载体，只要其能够通过同源重组与杆状病毒序列重组，从而将基因插入到杆状病毒的序列中。适用的转移载体对于本领域技术人员而言是熟知的。所述的转移载体的关键特征在下文中进一步地讨论。插入到杆状病毒序列中的基因可以是任意的异源基因(即非杆状病毒基因)。优选的是该异源基因编码蛋白质复合物的亚基。所述异源基因可以编码病毒蛋白、受体的组分或者分子伴侣复合物。尤其优选的是，该异源基因编码病毒蛋白，该病毒蛋白与其他的病毒蛋白一起可以形成病毒样颗粒(VLP)。基因插入到杆状病毒序列处的基因座可以是任意适用的基因座，本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于将基因插入到杆状病毒序列的基因座中的转移载体，所述转移载体包括：表达框，所述表达框包括可以与基因可操作地连接的真核启动子；双向选择框，所述双向选择框包括：（ｉ）编码第一个选择标记的可表达序列；和（ｉｉ）编码第二个选择标记的可表达序列；和位于表达框和双向选择框侧翼的序列，其中所述的序列大体上对应于杆状病毒序列中的基因座的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·罗伊，
申请(专利权)人：伦敦卫生及热带医学学院，
类型：发明
国别省市：GB