本发明专利技术公开了一种ZIKV特异性检测靶序列、质粒标准分子及其核酸检测试剂盒，该质粒标准分子为含有具有碱基组成SEQ ID NO：1的检测靶序列。所述核酸检测试剂盒为：由SEQ ID NO：2‑5组成的核酸检测巢式PCR引物体系，由SEQ ID NO:7‑9组成的核酸检测荧光定量PCR引物体系及SEQ ID NO：6的逆转录引物。本发明专利技术成功构建了ZIKV特异性质粒标准分子及其PCR检测体系，为人群及媒介蚊虫野生种群ZIKV携带背景调研与诊断建立了简便、价廉、特异的核酸检测体系。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物领域，主要涉及一种寨卡病毒(ZIKV)特异性检测靶序列、质粒标准分子及其核酸检测试剂盒。
技术介绍
寨卡病毒(ZikaVirus,ZIKV)是一种通过蚊虫传播的蚊媒病毒，属于黄病毒科黄病毒属，1947年首次在乌干达恒河猴中分离出。寨卡病毒感染人类引起的临床表现不特异如低热，皮疹，结膜炎，关节痛等。在之后的60年里，只在亚洲和非洲部分地区有散在的人类感染寨卡病毒的报告。2007年，寨卡病毒首次在亚洲和非洲之外的地区出现并且在西太平洋雅浦岛引起流行，随后迅速扩散至太平洋其他国家。2015年，巴西确认第一例本土寨卡病毒病例，并且确认病毒在多个地区形成流行，同时，在巴西东北部伴随有婴儿小头畸形发病率的提高。流行病调查显示，婴儿小头畸形的发生与孕妇感染寨卡病毒有关。2016年1月份，中国确诊第一例输入性寨卡病毒感染患者。传播寨卡病毒的蚊种主要为伊蚊，在我国有埃及伊蚊和白纹伊蚊的广泛分布。虽然寨卡病毒还没有在我国出现流行，但是随着国际交流，旅游等的日益便利频繁，病毒很有可能会传入中国，甚至引起大流行。特别是全球气候变暖，使得伊蚊繁殖更多，分布范围更广，更加加剧寨卡病毒传播的可能性。寨卡病毒感染的早期诊断是控制病毒传播的重要措施。检测蚊媒体内携带寨卡病毒的量，知晓蚊媒对病毒的感染率、传播率和扩散率对蚊媒的防控具有关键意义。目前，人群病人诊断的措施有血清学检查，抗原测定，病毒分离和病毒核酸检测，抗原抗体检测容易与其他黄病毒属病毒引起交叉反应，病毒分离消耗时间长。因此，开发一种能早期迅速的从病人和蚊媒中检测寨卡病毒的高度灵敏、特异且价廉、易用的检测方法刻不容缓。
技术实现思路
本专利技术需要解决技术方案之一是提供一种寨卡病毒特异性核酸检测靶序列。解决上述技术问题的技术方案的如下：构建的ZIKV特异性检测靶序列,具有SEQIDNO：1所示碱基组成。本专利技术另一目的是提供一种重组质粒或质粒标准分子或标准物质或E.coli工程菌菌株。实现上述目的的技术方案如下：一种包含有上述任一所述ZIKV特异性检测靶序列的重组质粒或质粒标准分子或标准物质；进一步以该重组质粒转染细菌E.coli，获得能用于生产该重组质粒的工程菌菌株。本专利技术的另一目的是提供ZIKV特异性核酸检测试剂盒。实现上述目的的技术方案如下：一种针对SEQIDNO：1的ZIKV特异性核酸检测试剂盒，包括有：碱基组成为SEQIDNO：2和SEQIDNO：3构成的巢式PCR外引物对，SEQIDNO：4和SEQIDNO：5构成的巢式PCR内引物对，以及由SEQIDNO：6所示碱基构成的逆转录引物，SEQIDNO：7和SEQIDNO：8构成的实时荧光定量PCR引物，由SEQIDNO：9所示碱基构成的荧光定量PCR探针。所述实时荧光定量PCR引物和荧光定量PCR探针的荧光报告基团均为FAM、JOE、ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或TexasRed中的至少一种；所述实时荧光定量PCR引物和荧光定量PCR探针的荧光淬灭基团均为MGB、BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、LowaBlackTMRQ或LowaBlackTMFQ中的至少一种。本专利技术基于大量深入的ZIKV基因组学生物信息学分析，其中结合部分核酸二级结构及功能分析，并进行数次核酸检测体系的实践性调校与优化，方获得本专利技术的ZIKV核酸检测体系。进一步为杜绝在核酸检测试剂潜存的阳性对照污染问题，本专利技术在ZIKV检测靶片段中经过优选的插入位点插入经过人工改造的内含子片段mINTRON-T，构建了可供ZIKV核酸检测用的新型标准质粒分子，其具有SEQIDNO：1所示碱基组成。经过测试，证实本专利技术所构建的ZIKV特异性的核酸检测试剂盒是有效、可行、敏感特异、价廉简便的能应用媒介蚊虫等ZIKV携带情况的检测。附图说明图1是PR-out-F(SEQIDNO：2)和PR-out-R(SEQIDNO：3)引物对ZIKV病毒株PCR扩增电泳图；其中，Lane1：扩增条带与预期大小313bp相符。图2是新型标准质粒分子pBmRD-T构建示意图；其中：横向白色箭头所示为能检测ZIKV特异性巢式PCR外巢引物对(PR-out-F，SEQIDNO：2和PR-out-R，SEQIDNO：3)；黑色箭头所示为ZIKV特异性内巢引物对(PR-in-F,SEQIDNO：4和PR-in-R,SEQIDNO：5)；浅灰色箭头及黄色小图形示意为ZIKV特异性qPCR引物和探针(PR-Q-F,SEQIDNO：7和PR-Q-R,SEQIDNO：8，PR-Q-Pro,SEQIDNO：9)；黑色片段示意为ZIKV病毒株扩增片段，PCR产物预期大小为313bp/261bp；深灰色片段示插入人工改造的mINTRON-T序列片段，为50bp的插入子，因而，所构建的新型标准质粒分子作为阳性参照所扩增的阳性PCR产物预期大小为363bp/311bp。该标准质粒分子一方面能较好地检测试剂体系的有效性；另一方面，能简易地自不同的分子量大小区分可能因用户的操作或环境因素的影响而出现的来自阳性对照的潜在污染情况。图3是CR扩增产物电泳图；其中，A：PR-Insert-F和PR-out-R对ZIKV病毒株PCR扩增产物FragA电泳图，Lane1：PCR产物如预期大小236bp，B：PR-out-F和PR-Insert-R对公司合成的重组质粒pUC19--B的PCR扩增产物FragB电泳图，Lane1：PCR产物如预期大小177bp，C：PR-out-F和PR-out-R对FragA+FragB连接产物的PCR扩增电泳图，Lane1：PCR产物如预期大小363bp，D：新型标准质粒分子pBmRD-T的双酶切鉴定，Lane1：酶切插入子片段如预期大小436bp(克隆片段363bp+质粒片段73bp)，M：DNA标准分子量。图4是巢式PCR扩增pBmRD-T的LOD测试的电泳图；其中，A：PR-out-F和PR-out-R对pBmRD-T的PCR扩增LOD测试，M：DNA标准分子量，Lane1-14：新型标准质粒分子pBmRD-T梯度稀释依次为1010-105copies，2000copies，400copies，80copies，40copies，20copies，10copies，5copies，1copy的外巢PCR扩增，可见外巢PCR的LOD为400copies，Lane15：空白对照；B：巢式PCR体系对pBmRD-T的LOD测试，M：DNA标准分子量，Lane1-6：新型标准质粒分子pBmRD-T分别稀释至80copies，40copies，20copies，10copies，5copies，1copy，可见该LOD为5copies，Lane7-8：空白对照。图5是巢式PCR检测体系对ZIKV病毒株检测的扩增条件优化的电泳图；其中A：外巢引物对(PR-out-F和PR-out-R)的退火温度条件优化，M：DNA标准分子量，Lane1-6：退火温度分别为51.4℃，54.6℃，59.9℃，63.1℃，64.5℃，B：内巢引物对(PR-in-F和PR-in-R)的退火温度条件优化，M：DNA标准分子量，Lane1-6：退火温度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种寨卡病毒特异性检测靶序列,其特征是，具有SEQ ID NO：1所示碱基组成。
【技术特征摘要】
1.一种寨卡病毒特异性检测靶序列,其特征是，具有SEQIDNO：1所示碱基组成。2.一种包含有权利要求1所述寨卡病毒特异性检测靶序列的重组质粒或质粒标准分子或标准物质或工程菌菌株。3.一种针对权利要求1所述特异性检测靶序列的寨卡病毒特异性检测试剂盒，其特征是，主要包括有：碱基组成为SEQIDNO：2和SEQIDNO：3构成的巢式PCR外引物对、SEQIDNO：4和SEQIDNO：5构成的巢式PCR内引物对，由SEQIDNO：6所示碱基构成的逆转录引物，SEQIDNO:7和SEQIDNO：8构成的实时荧光...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢甜，尹庆庆，刘转转，周晓红，陈晓光，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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