全细胞疫苗制造技术

本公开涉及表达聚糖和糖缀合物抗原的减毒细菌细胞及其在制造有效预防或治疗非人类物种中的细菌感染的全细胞疫苗中的用途。

Whole cell vaccine

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】全细胞疫苗专利
本公开涉及表达聚糖和糖缀合物抗原的减毒细菌细胞及其在制造有效引发非人类动物物种中的免疫应答以及预防或治疗细菌感染的全细胞疫苗或免疫原性组合物中的用途。专利技术背景由于动物产品需求的增长，动物健康面临着新的和额外的挑战。尽管降低了动物生长和生产的成本，但数百只动物(诸如猪、牛或鸡)的限制和收容显著增加了疾病的发生率和传播。动物疾病不仅与经济风险(诸如生产力损失、市场破坏或农民的生计风险)相关，还具有人类健康风险的影响。维持健康的牲畜对于经济和社会的繁荣至关重要，然而，疫苗在兽医学中的应用和发展尚不成熟，主要是因为必须降低动物接种疫苗的成本并且因为我们对导致动物疾病的病原体的认识并不像对感染人类的那些病原体的认识一样先进。例如，糖缀合物疫苗在人类中广泛使用；然而，由于它们开发成本仍然很高，兽医应用受到限制。致病性细菌是影响动物的传染病的主要原因。在农业上重要的动物物种中控制细菌感染是有问题的，因为动物彼此非常接近，这可以促进整个畜群中感染的散播。当较大比例的动物对特定感染因子免疫时，畜群免疫力存在，但是一旦大量非免疫动物存在于畜群中时畜群免疫力可能会被破坏。为了实现畜群免疫力，有必要持续监测动物的畜群易感性成员以控制传播。细菌传播的控制是通过许多措施来实施的，这些措施是劳动密集的以及实施起来很昂贵，并且包括隔离检疫；消除动物感染库；环境控制[即维持清洁水和食物供应，卫生处理排泄物，空气卫生]；使用抗生素；使用益生菌来增强非致病性细菌的生长，和抑制致病性细菌的生长以及主动免疫以增加畜群的抗性成员的数量。通常对细菌感染具有抗性的畜群的产生需要鉴定形成诱导免疫力的疫苗基础的抗原。此外，动物物种携带也会感染人类的细菌病原体。动物传染病是一种从非人类动物可传播给人类的传染病。由革兰氏阴性细菌导致的动物传染病的细菌感染的实例包括：从受细菌污染的奶和肉传播到人类的由布鲁氏菌(Brucellaspp)导致的布鲁氏菌病；由弯曲杆菌(Campylobacterspp)导致的弯曲杆菌病；由霍乱弧菌导致的霍乱；由来自受细菌污染的未煮过的肉和未经高温消毒的奶的耶尔森氏菌(Yersinaspp)导致的耶尔森氏菌病；以及由来自受细菌污染的肉、特别是猪肉和蛋的沙门氏菌(Salmonellaspp)导致的沙门氏菌病。有由各种细菌引起的各种各样的疾病(例如鸡的大肠杆菌病、奶牛的乳腺炎或猪的呼吸系统疾病)可以影响牲畜。一旦感染发生，治疗选择是有限的，通常依赖于昂贵的抗生素，并且更重要的是它们的重复使用促成抗性的发展。因此，保护性疫苗接种是优选的方法，通常预防并有助于根除非人类动物疾病。成功疫苗的定义性特征是能够以最小的副作用引起持久的保护性免疫应答。大多数兽用疫苗都是基于活的减毒细菌菌株或不含抗原活性组分的产品，诸如灭活的全细胞疫苗或仅含有病原体的抗原性部分的亚单位疫苗(基于蛋白质或碳水化合物亚基、重组蛋白、肽或基于核酸的产品)。包含碳水化合物特异性抗原的糖缀合物疫苗可以提供针对多种致病性细菌的保护。然而，糖缀合物疫苗通常遭受低免疫原性并且不能产生足够的记忆B淋巴细胞细胞应答。多糖抗原与蛋白质载体的偶联产生的糖缀合物显著增加免疫原性。目前许可的人糖缀合物疫苗包括针对流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisserriameningitidis)和肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)的那些糖缀合物疫苗，其包含与载体蛋白化学结合的细菌多糖。流感嗜血杆菌B型(Hib)疫苗或(针对由肺炎链球菌引起的疾病有保护作用的13价基于荚膜的糖缀合物疫苗)使用载体蛋白iCRM197(从白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)中分离出来的无毒形式的白喉毒素)。这些糖缀合物疫苗是有效的，但它们的生产需要从天然病原体中纯化多糖聚糖并且将多糖与合适的蛋白质载体化学偶联，这是一种高成本，低效和耗时的过程。从细菌来源获得或通过化学合成获得聚糖。载体蛋白通常是细菌毒素如破伤风和白喉(最常见的是重组形式，CRM197)，尽管已经使用了其它载体。例如，钥孔血蓝蛋白(KLH)已经经常被用于动物疫苗研究。聚糖与载体蛋白的偶联需要聚糖和/或载体的化学活化，这通常需要几个步骤并产生异源性产物。包含能够将抗原性多糖聚糖转移到蛋白质载体上的寡糖转移酶的修饰细菌菌株的使用为糖缀合物的生产提供了经济的可替代方法，并且是本领域已知的。在WO2009/104074或WO2014/114926中公开了在细菌表达系统中用于人用的糖缀合物疫苗的产生。在细菌表达系统中产生糖缀合物需要三个基因的共表达：受体蛋白质、多糖生物合成基因座以及用于偶联反应的寡糖转移酶。然而，仅在一个宿主中共表达通常导致次优的产量，这使其商业化不可行。本公开使用聚糖偶联技术，以通过引入编码抗原性多糖、寡糖转移酶和受体蛋白的转录盒作为质粒的一部分或直接插入基因组，来在活的减毒全细胞疫苗中表达一种或多种致病性细菌的抗原性多糖，从而增加它们对多种病原体的保护谱。此外，还公开了具有降低的翻译效率的重组表达系统，其包含寡糖转移酶、毒性载体蛋白或编码聚糖生物合成所需蛋白质的基因。通过提供核糖体结合位点[RBS]与翻译起始密码子之间的距离增加的载体来降低翻译效率，从而使细菌生长到高密度并避免在对细菌细胞有毒的浓度下表达重组蛋白的有害影响。
技术实现思路
根据本专利技术的一方面，提供了致病性细菌细胞，其中所述细胞转化了包含生物合成基因座的转录盒，所述生物合成基因座包含并非由所述转化的致病性细菌细胞表达的异源性聚糖抗原合成所需的一种或多种多肽，其中所述异源聚糖抗原在细菌细胞表面处被表达。根据本专利技术的一方面，提供了致病性细菌细胞，其中所述细胞转化了一种或多种转录盒，所述一种或多种转录盒包含：核酸分子，其编码寡糖转移酶多肽，核酸分子，其编码作为所述寡糖转移酶的底物的包含至少一个糖基化位点的一种或多种载体多肽，和核酸分子，其编码生物合成基因座，所述生物合成基因座包含并非由所述转化的致病性细菌细胞表达的异源聚糖抗原合成所需的一种或多种多肽，特征在于所述致病性细菌细胞是减毒的并且所述异源聚糖抗原在所述细菌细胞表面处被表达，并且其中所述异源聚糖还被偶联至所述载体多肽以提供保留在所述减毒的致病性细菌细胞内的糖缀合物。在本专利技术另一优选的实施方案中，所述细菌细胞包含至少一个编码膜多肽或膜相关多肽的失活的或经突变的基因，其中活的致病性细菌细胞是减毒的并且所述减毒是所述基因失活或突变的结果。在本专利技术优选的实施方案中，至少2、3或更多个基因是失活的或经突变的。在本专利技术优选的实施方案中，所述基因选自：编码分选酶的基因和/或编码多糖修饰酶的基因，其中所述修饰与所述分选酶或多糖修饰基因的表达的失活或抑制相关。在本专利技术优选的实施方案中，编码所述分选酶的基因由选自以下的核苷酸序列编码：i)核酸分子，其包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；ii)核酸分子，其包含其中所述序列对于(i)中所限定的核苷酸序列是遗传密码简并的结果的核苷酸序列，；和iii)核酸分子，其互补链在严格杂交条件下杂交与上述i)和ii)中的核苷酸序列杂交，其中所述核酸分子编码分选酶。在本专利技术优选的实施方案中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.致病性细菌细胞，其中所述细胞转化了一个或多个转录盒，所述一个或多个转录盒包含：核酸分子，其编码寡糖转移酶多肽，核酸分子，其编码作为所述寡糖转移酶的底物的包含至少一个糖基化位点的一种或多种载体多肽，和核酸分子，其编码生物合成基因座，所述生物合成基因座包含并非由所述转化的致病性细菌细胞表达的异源聚糖抗原合成所需的一种或多种多肽，特征在于所述致病性细菌细胞是减毒的并且所述异源聚糖抗原在所述细菌细胞表面处被表达，并且其中所述异源聚糖还被偶联至所述载体多肽以提供保留在所述减毒的致病性细菌细胞内的糖缀合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.03.15 GB 1704108.8;2017.03.15 GB 1704103.91.致病性细菌细胞，其中所述细胞转化了一个或多个转录盒，所述一个或多个转录盒包含：核酸分子，其编码寡糖转移酶多肽，核酸分子，其编码作为所述寡糖转移酶的底物的包含至少一个糖基化位点的一种或多种载体多肽，和核酸分子，其编码生物合成基因座，所述生物合成基因座包含并非由所述转化的致病性细菌细胞表达的异源聚糖抗原合成所需的一种或多种多肽，特征在于所述致病性细菌细胞是减毒的并且所述异源聚糖抗原在所述细菌细胞表面处被表达，并且其中所述异源聚糖还被偶联至所述载体多肽以提供保留在所述减毒的致病性细菌细胞内的糖缀合物。2.根据权利要求1所述的致病性细菌细胞，其中所述细菌细胞包含至少一个编码膜多肽或膜相关多肽的失活的或经突变的基因，其中活的致病性细菌细胞是减毒的并且所述减毒是所述基因失活或突变的结果。3.根据权利要求1或2所述的致病性细菌细胞，其中所述基因选自：编码分选酶的基因和/或编码多糖修饰酶的基因，其中所述修饰与所述分选酶或多糖修饰基因的表达的失活或抑制相关。4.根据权利要求3所述的致病性细菌细胞，其中编码所述分选酶的基因由选自以下的核苷酸序列编码：i)核酸分子，其包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；ii)核酸分子，其包含其中所述序列对于(i)中所限定的核苷酸序列是遗传密码简并的结果的核苷酸序列，；和iii)核酸分子，其互补链在严格杂交条件下杂交与上述i)和ii)中的核苷酸序列杂交，其中所述核酸分子编码分选酶。5.根据权利要求3所述的致病性细菌细胞，其中编码所述分选酶的基因由选自以下的核苷酸序列编码：i)核酸分子，其包含如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的；ii)核酸分子，其包含其中所述序列对于(i)中所限定的核苷酸序列是遗传密码简并的结果的核苷酸序列；和iii)核酸分子，其互补链在严格杂交条件下与上述i)和ii)中的核苷酸序列杂交，其中所述核酸分子编码分选酶。6.根据权利要求3所述的致病性细菌细胞，其中编码所述多糖修饰酶的基因由选自以下的核苷酸序列编码：i)核酸分子，其包含如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；ii)核酸分子，其包含其中所述序列对于(i)中所限定的核苷酸序列是遗传密码简并的结果的核苷酸序列；和ii)核酸分子，其互补链在严格杂交条件下与上述i)和ii)中的核苷酸序列杂交，其中所述核酸分子编码多糖修饰酶。7.根据权利要求3至6中任一项所述的致病性细菌细胞，其中编码所述分选酶和/或所述多糖修饰酶的所述基因通过编码所述分选酶和/或多糖修饰酶的核苷酸序列的全部或部分的缺失，或者控制所述分选酶和/或多糖修饰酶的表达的调节区的全部或部分的缺失而被修饰。8.根据权利要求1至7中任一项所述的致病性细菌细胞，其中所述寡糖转移酶是弯曲杆菌属寡糖转移酶。9.根据权利要求8所述的致病性细菌细胞，其中所述弯曲杆菌属寡糖转移酶是空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)寡糖转移酶。10.根据权利要求8所述的致病性细菌细胞，其中所述弯曲杆菌属寡糖转移酶是生痰弯曲杆菌(Campylobactersputorum)寡糖转移酶。11.根据权利要求9所述的致病性细菌细胞，其中所述寡糖转移酶由包含如SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的核酸分子编码，或者由包含与SEQIDNO:4所示的全长核苷酸序列具有至少50％核苷酸序列同一性的核苷酸序列的核酸分子编码。12.根据权利要求10所述的致病性细菌细胞，其中所述寡糖转移酶由包含如SEQIDNO:5或6所示的核苷酸序列的核酸分子编码，或者由包含与SEQIDNO:5或6所示的全长核苷酸序列具有至少50％核苷酸序列同一性的核苷酸序列的核酸分子编码。13.根据权利要求9或11所述的致病性细菌细胞，其中所述寡糖转移酶由SEQIDNO:7所示的氨基酸序列表示，或者由与SEQIDNO:7所示的全长氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列表示。14.根据权利要求10或12所述的致病性细菌细胞，其中所述寡糖转移酶由SEQIDNO:8所示的氨基酸序列表示，或者由与SEQIDNO:8所示的全长氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列表示。15.根据权利要求1至14中任一项所述的致病性细菌细胞，其中所述载体多肽包含氨基酸基序：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸，或其中所述受体多肽包括氨基酸基序：D/E-X-N-X-S/T，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。16.根据权利要求1至15中任一项所述的致病性细菌细胞，其中,所述载体多肽是由所述减毒的致病性细菌细胞的基因组编码的内源性载体多肽。17.根据权利要求1至16中任一项所述的致病性细菌细胞，其中所述载体多肽是由不是由所述减毒的致病性细菌细胞天然表达的核酸分子编码的异源性载体多肽。18.根据权利要求17所述的致病性细菌细胞，其中所述异源性载体多肽由从致病性细菌物种分离的核酸分子编码。19.根据权利要求17或18所述的致病性细菌细胞，其中所述异源性载体多肽由如SEQIDNO:9、10或11所示的核苷酸序列编码。20.根据权利要求1至19中任一项所述的致病性细菌细胞，其中编码包含异源聚糖抗原合成所需的一种或多种多肽的生物合成基因座的所述核酸分子，编码荚膜多糖。21.根据权利要求20所述的致病性细菌细胞，其中所述多糖是O-抗原。22.根据权利要求20所述的致病性细菌细胞，其中所述多糖是七糖。23.根据权利要求20所述的致病性细菌细胞，其中所述生物合成基因座包含含有如SEQIDNO:12所示的核苷酸序列的核酸分子。24.根据权利要求1至23中任一项所述的致病性细菌细胞，其中编码所述寡糖转移酶的所述核酸分子稳定地整合至所述减毒的致病性细菌细胞的基因组中。25.根据权利要求1至24中任一项所述的致病性细菌细胞，其中编码所述载体多肽的所述核酸分子稳定地整合至所述减毒的致病性细菌细胞的基因组中。26.根据权利要求1至25中任一项所述的致病性细菌细胞，其中编码所述生物合成基因座的所述核酸分子稳定地整合至所述减毒的致病性细菌细胞的基因组中。27.根据权利要求1至26中任一项所述的致病性细菌细胞，其中所述生物合成基因座是Pgl基因座。28.根据权利要求27所述的致病性细菌细胞，其中所述Pgl基因座包含编码选自以下的所述一种或多种多肽的基因：PglG、PglF、PglE、Cj1122c、PglD、PglC、PglA、PglJ、PglI、PglH、PglK。...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔恩·库崔，布伦丹·雷恩，亚历山德拉·福尔兹佩恩，
申请(专利权)人：伦敦卫生及热带医学学院，
类型：发明
国别省市：英国,GB