一种鸡滑液囊支原体的减毒疫苗的制备方法技术

本发明专利技术为了研究一种可以预防鸡滑液囊支原体病的减毒疫苗，通过体外传代培养获得H95减毒滑液囊支原体菌株，将H95菌株以1:1比例与白油佐剂进行混合制备减毒疫苗、采用不同免疫剂量免疫鸡群来研究该菌株对鸡的免疫效果，并通过致病性野毒株进行动物感染研究，验证H95减毒株制备的减毒疫苗对鸡滑液囊支原体的预防效果。本发明专利技术提供了一种可以预防鸡滑液囊支原体病的减毒疫苗的制备方法和有效的免疫剂量，为临床预防鸡滑液囊支原体病提供了科学依据。

Preparation of attenuated vaccine against Mycoplasma synovialis in chickens

【技术实现步骤摘要】
一种鸡滑液囊支原体的减毒疫苗的制备方法
本专利技术涉及一种鸡滑液囊支原体的减毒疫苗的制备方法。
技术介绍
鸡滑液囊支原体（Mycoplasmasynoviae,MS）是一种世界范围内主要引起鸡关节肿大、滑液囊和腱鞘发炎的重要病原。近几年，该病在全国呈逐年上升趋势，严重影响了养禽业的健康发展。鸡滑液囊支原体病一年四季均可发生，但冬季早春易发，各种日龄鸡只都可感然，雏鸡易感性比成年鸡要高，抵抗力随日龄的增长而加强，外来引进品种或品系发病率高于本地品种。发病鸡群抵抗力下降，且在发病初期,因临床症状不明显，并且易于与多种禽类疾病相混淆，所以不易引起养殖者的重视,不能够及时采取相应的预防措施，加剧病情，增加死亡率，因此造成该病快速流行并给养殖企业造成巨大的经济损失。同鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum,MG)一样，鸡滑液囊支原体感染已遍及全球。在我国，无论是商品肉鸡、蛋鸡或种鸡，MS感染均有发生。因此，防控鸡滑液囊支原体病，净化种鸡群对养禽业的发展意义重大。针对鸡滑液囊支原体病的控制主要是通过疫苗免疫和药物控制两种方法，到目前为止，仅澳大利亚等国家有商品化的MS灭活疫苗和弱毒疫苗应用，且效果并不是很理想。而我国养殖场主要靠抗菌药物控制该病，但药物防治效果不佳的情况越来越明显。主要是支原体无细胞壁，对多种抗生素不敏感，抗生素治疗不能消除鸡群中MS感染。如何控制MS的传播，疫苗研究成为了防控鸡滑液囊支原体病的关键。在疫苗研究方面，主要是能够研制出更加有效安全的新疫苗，因此开发新型的鸡滑液囊支原体的减毒疫苗成为了一种趋势。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鸡滑液囊支原体的减毒疫苗的制备方法，制备的减毒疫苗作用时间持久、高效稳定、无临床症状，适用于预防鸡滑液囊支原体。本专利技术的鸡滑液囊支原体减毒疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其中抗原为鸡滑液囊支原体HLB-1菌株(MycoplasmasynoviaeHLB-1)。已保藏于宁夏大学实验室，保藏日期为2017年3月3日。其中HLB-1株的减毒方法是通过体外传代使其自然变异弱化。本专利技术的疫苗，其制备方法如下：按照培养管容积的80%加入鸡滑液囊支原体改良Frey氏液体培养基，菌株种子接种量为10%、培养温度为37°、震荡速度为200r/min、培养24〜30小时后菌液由红变黄时收获菌液作为种子菌液；菌株传代弱化：完成扩增的HLB-1菌株编号为H1，按10%的比例接种到装有80%改良Frey氏液体培养基新的培养管中，编号为H2，按同样的方法接种传代，编号为H3，依次递推，直至编号为H95；油相制备：取同H95菌液相同体积的注射用白油，剧烈震荡乳化后，115℃灭菌40分钟，冷却后备用；疫苗制备：扩增完成后的H95菌液按1:1的比例与剧烈震荡乳化后的注射用白油混合，在H95菌液中缓缓加入乳化后的注射用白油，再以15000r/min搅拌5分钟完成制备。本专利技术的疫苗能够产生较高水平的抗体，持续期长，有交叉保护性，免疫后能够有效预防鸡滑液囊支原体病的发生。国内尚无鸡滑液囊支原体疫苗上市，用本专利技术的鸡滑液囊支原体H95株制备鸡滑液囊支原体减毒疫苗是防控该病的关键，冋时也能弥补市场空缺。附图说明图1是菌株HLB-1株PCR特异性检验图。图2是鸡滑液囊支原体HLB-1株基因序列进化树图图3是关节剖检图注：A为对照组；B为试验组。图4是肝脏剖检图注：A为对照组；B为试验组。图5是脾脏剖检图注：A为对照组；B为试验组。图6是关节病理组织切片观察图注：A为对照组（HE，40ⅹ）；B为试验组（HE，40ⅹ）。图7是肝脏病理组织切片观察图注：A为对照组（HE，400ⅹ）；B为试验组（HE，400ⅹ）图8是脾脏病理组织切片图注：A为对照组（HE，400ⅹ）；B为试验组（HE，400ⅹ）。图9是梯度免疫接种和人工攻毒试验血清抗体水平变化图。图10是梯度免疫接种和人工攻毒试验体温变化图。图11是人工攻毒后体重增长变化图。图12是肝脏剖检结果图。图13是脾脏剖检结果图。图14是附关节剖检结果图。图15是肝脏病理组织切片观察图(HE，400ⅹ)。图16是脾脏病理组织切片观察图（HE，400ⅹ）。图17是关节病理组织切片观察图（HE，40ⅹ）。具体实施方式实施例1：菌株的筛选：1鸡滑液囊支原体生产用培养基1.1鸡滑液囊支原体改良Frey液体培养基（购自北京中海生物科技有限公司）；1.2鸡滑液囊支原体改良Frey固体培养基（购自北京中海生物科技有限公司）；2鸡滑液囊支原体分离、鉴定2.1病原菌分离：在宁夏某养鸡场，疑似发生了典型的传染性滑膜炎症状，分离出血清。对分离出的血清进行ELISA检测，观察检测结果，判断出感染鸡体内含有MS病原体。从发病鸡上的腿部关节中采集关节液，接种于改良Frey液体培养基，置37°C，200r/min振荡培养24〜48小时，待接种后的液体培养基的颜色由红变成橘黄时收获，传代，取第2代(H2代)菌液进行鉴定。2.2病原菌鉴定形态观察：鸡滑液囊支原体分离株(命名为:HLB-1株)经鸡滑液囊支原体改良Frey固体培养基，菌体形态为滑液囊支原体典型的“煎蛋样”菌落形态；将分离到的菌株接种于不含青霉素和醋酸铊等抑菌物质的改良Frey氏液体培养基中，连续12次传代后，分离物保持MS应具有的形态，并且它可以通过0.45μm过滤器，说明分离株不是L细菌；生化特性：鸡滑液囊支原体分离株HLB-1株能发酵葡萄糖及麦芽糖，产酸不产气；不发酵乳糖，不能分解精氨酸；细菌L型鉴定均为阴性;可凝集鸡的红细胞；特异性：分子生物学鉴定用鸡滑液囊支原体特异性引物进行PCR扩增，结果HLB-1株能扩增出约773bp的特异性片段（图1）。2.3鸡滑液囊支原体HLB-1株VlhA基因序列测定与分析2.3.1引物设计根据GenBank中收录的鸡滑液囊支原体VlhA基因，比对后针对保守区设计引物，由上海生物工程有限公司合成。该引物扩增的目的片段大小为773bp，引物序列如下所示：ForwardPrime：5'-GCCATTGCTCCTGCTGTTATA-3'；ReversePrime：5'–GGGTAGTCCACTCGCATT-3'。2.3.2DNA模板的制备：取HLB-1株培养物3mL,采用康为世纪细菌基因组DNA提取试剂盒提取鸡滑液囊支原体基因组DNA。方法如下：（1）取菌种培养物3mL置于离心管中，12000rpm离心2min，尽量吸净上清液。（2）加200μlBufferGA到沉淀中，振荡菌体至彻底悬浮。（3）加入20μLProteinaseK，涡旋振荡，混匀。（4）加入220μL缓冲液BufferGB，震荡15sec，70℃孵育10min，简短离心去除水珠。（5）加入220μL无水C2H5OH，涡旋振荡15sec，充分混匀，简短离心去除壁内的水珠。（6）将步骤5中溶液全部加入到吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CB3放回收集管中。（7）加BufferGD500ul到吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放回收集管中。（8）加BufferPW600ul到吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，弃倒掉废液，吸附柱CB3放回收集管中。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡滑液囊支原体的减毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述的疫苗包含抗原和疫苗佐剂，其中抗原为减毒株H95株。

【技术特征摘要】
1.一种鸡滑液囊支原体的减毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述的疫苗包含抗原和疫苗佐剂，其中抗原为减毒株H95株。2.如权利要求1所述的减毒疫苗，其特征在于，所述的减毒株H95株为HLB-1菌株经体外传代95次获得。3.如权利要求1所述的减毒疫苗，其特征在于，所用佐剂为白油佐剂。4.如权利要求1所述的减毒株H95株的制备方法，包括如下的步骤：（1）无菌操作台中在无菌的5ml的离心管中装3ml改良Frey氏液体培养基制成培养管；（2）菌株复苏：将-80℃冻存的HLB-1菌株按10%的比例接种在培养管中，密封，置恒温37℃、150～200r/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：何生虎，郭朋辉，郭亚男，姜肖军，刘凡，陈秀红，郭磊，魏晓明，
申请(专利权)人：宁夏大学，宁夏晓鸣农牧股份有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏,64