表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒被命名为重组火鸡疱疹病毒rHVT‑F株，该病毒株是将含鸡新城疫病毒F基因的表达盒与火鸡疱疹病毒(HVT)结合在一起，即通过将由CMV启动子控制下的F基因插入到HVT基因组中，构建而获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒rHVT‑F株，该rHVT‑F株病毒不仅可以对鸡可以诱导产生抗MD和ND的持久保护性免疫。该株病毒作生产毒株制备马立克氏病和鸡新城疫病的二联重组疫苗。

The construction and application of the expression of F gene of Newcastle disease virus recombinant herpesvirus of Turkey

The invention relates to a strain of Newcastle disease virus F gene expression of the recombinant herpesvirus of turkey named rHVT recombinant turkey herpesvirus F strain, the strain is containing Newcastle disease virus F gene expression cassette and herpes simplex virus (HVT) together, which is under the control of CMV promoter of F gene insertion the genome of HVT, construct and acquired a new recombinant turkey herpesvirus rHVT F strain, the rHVT F virus can not only induce long-lasting protective immunity against MD and ND on the chicken can. The virus was used as a production strain to prepare two recombinant vaccines against Marek's disease and chicken Newcastle disease.

【技术实现步骤摘要】
表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用
本专利技术涉及一种表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用，属于动物病毒学领域。本专利技术提供了一种重组火鸡疱疹病毒rHVT-F株，其基因组中包含有CMV启动子控制下的鸡新城疫病毒(NDV)F基因。
技术介绍
鸡马立克氏病(Marek’sdisease，MD)和鸡新城疫病(newcastledisease,ND)给养禽业造成极大的危害。对于MD、ND的防控主要是依靠疫苗的预防接种。HVT对鸡及其它动物均无致病性，自1970年以来普遍用于MDV的防控。目前，绝大多数国家采用预防接种作为控制新城疫的主要措施。但由于常规疫苗的免疫保护期短，虽然商品鸡群在整个饲养期内多次进行免疫接种，但是仍有可能感染NDV强毒，造成非典型新城疫病毒的流行。此外，常规弱毒疫苗和中等毒力疫苗还可在鸡呼吸道复制，引起温和的病变，增加了继发细菌感染的易感性。为了弥补常规疫苗的不足，国内外许多实验室从20世纪80年代末开始利用重组技术研制新城疫病毒基因工程疫苗。其中基因工程活载体疫苗，是疫苗研制与开发的主要方向之一。火鸡疱疹病毒(Herpesvirusofturkey,HVT)作为载体疫苗对鸡及其他动物均无致病性，接种后可刺激机体产生较高水平的抗体并维持终生，接种一次即可获得终生免疫，同时HVT是预防马立克氏病(MDV)的常规疫苗。HVT作为载体具有以下优势：(1)HVT已经广泛的应用于1日龄雏鸡的免疫，已近50年历史，其疫苗生产、储存和接种等都有十分成熟的方法；(2)HVT极为安全，对鸡不具有任何副作用；(3)接种鸡后终身带毒，可以长时间刺激机体产生免疫反应，达到理想的免疫保护效果；(4)HVT在CEF细胞上生长迅速，产生大量有囊膜的病毒，这样制备的冻干疫苗在4℃可以长期保存，使用方便；(5)即使在密度很高的鸡群，HVT也不易发生水平传播，因而减少了重组疫苗散毒的风险。本专利技术通过在细胞水平的同源重组，构建成一株能够稳定表达NDVF基因的重组HVT毒株，并制备基因工程疫苗，用于鸡群的免疫接种，同时产生对MD、ND的免疫保护。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种采用生物技术构建的重组火鸡疱疹病毒(rHVT-F)，其基因组中包含有CMV启动子控制下的鸡新城疫病毒(NDV)F基因，，其实际上是将含NDV的F基因与火鸡疱疹病毒HVT结合在一起，获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒rHVT-F，该病毒同时也是一种制备马立克氏病和鸡新城疫病二联疫苗的生产毒种，是通过将由CMV启动子控制下的NDVF基因插入到HVT基因组中，rHVT-F不仅可以对鸡MD起到良好的免疫保护作用，而且可以诱导抗NDV的持久保护性免疫。本专利技术的技术方案1.一株表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于该重组火鸡疱疹病毒携带在CMV启动子序列控制下的鸡新城疫病毒的F基因的表达盒，该表达盒的基因序列如SeqIDNo:1所示，该病毒被命名为重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirusofturkey,HVT)rHVT-F株，并已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.13396。2.如本专利技术所述一种表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于，重组病毒株该在禽类宿主中诱导抗马立克氏病病毒和鸡新城疫病毒的保护性免疫并作为生产毒株用于制备相应的疫苗。3.如本专利技术所述一种表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于该重组病毒rHVT-F株，作为病毒载体构建新的重组病毒株中的应用。本专利技术具体实施方式本发所述的明重组火鸡疱疹病毒的DNA序列模式图如附图1所示，其构建的具体方法如下：在本专利技术中，专利技术人将含有鸡新城疫病毒F基因的表达盒(序列见序列1)插入HVT基因组中，插入的区域为HVT基因组中病毒生长非必需的区域(US10和SORF3之间)，插入序列及位置见图2。为了达到上述的目的，专利技术人首先：1.获得了含NDVF基因的表达盒，具体如下：设计扩增NDVF基因引物NDV-F-F/R(序列2/序列3)。以提取的NDVRNA为模板，经过RT-PCR扩增NDVF基因片段，经过NheI、XbaI双酶切后，克隆进真核表达载体pcDNA3.1(赛默飞世尔科技)，获得的阳性质粒，命名为pcDNA3.1/NDV-F。按照Lipofectamine2000(赛默飞世尔科技)转染方法将重组质粒pcDNA3.1/NDV-F转染CEF细胞，以NDVF蛋白的单克隆抗体作为一抗，鉴定重组质粒F蛋白的表达。根据pcDNA3.1载体BGHpolyA序列，设计引物BGH-F/R(序列4/序列5)扩增BGHpolyA片段，经XbaI、SphI酶切后克隆进pUC18载体(宝生物工程有限公司)，阳性质粒命名为pUC18/BGH。根据Genebank提供的HVTFC-126株(AF291866)基因序列，设计引物Tongyuan-down-F/R(序列6/序列7)、Tongyuan-up-F/R(序列8/序列9)分别扩增重组位点上下游同源臂。下游同源臂经SphI、HindIII双酶切，上游同源臂经EcoRI、XbaI双酶切依次克隆进pUC18/BGH质粒，重组质粒命名为pUC18/BGH/Tongyuan。利用引物PNDV-F-F/R(序列10/序列11)扩增cmv启动子以及NDVF基因，经ClaI、XbaI双酶切后克隆进pUC18/BGH/Tongyuan质粒，含有同源臂、NDVF基因表达盒的重组质粒命名为pUC18/NDV-F。2.重组病毒rHVT(rHVT-F)的构建利用同源重组的方法构建重组病毒rHVT-F，步骤如下：将长成单层的原代CEF细胞用胰酶消化，以6～8×106细胞接种到35mm的平皿，待细胞长至80％～90％时用于DNA转染。取1μgHVT感染的CEFDNA与2.5μgpUC18/NDV-F质粒DNA共同转染原代CEF。具体操作方法按Lipofectamine2000(赛默飞世尔科技)使用说明书进行。待培养至第4天，出现病毒蚀斑，用0.05％胰酶消化细胞，同时接种到新鲜制备2块35mm的平皿上。取其中一块以NDVF蛋白单克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光法鉴定，如果出现带荧光的病毒蚀斑，另一块经超声破碎后接种到新鲜制备96孔板继续培养，培养3-4d，再孔对孔接种到两块新鲜制备96孔板继续培养，3～4d后取一块固定进行间接免疫荧光法鉴定，另一块作为筛选阳性克隆的储备板。在96孔板中挑选独立的经IFA检测阳性的蚀斑继续用96孔板筛选，如此重复下去直到筛选出表达F蛋白的纯化的重组病毒，命名为HVT-F1。提取纯化病毒的基因组DNA，采用引物(序列12/序列13)进行PCR鉴定。HVT-F:5'-CATAGGCACGCTCTGATG-3'；18(序列12)HVT-R:5'-TGGCAAACAGTAAAATTATCC-3')21(序列13)。3.rHVT-F的体外的稳定性试验为了验证所获得的重组病毒rHVT-F体内和体外的稳定性，具体操作如下：将纯化的重组病毒HVT-F1在CEF细胞上连续传代，分别选取第10、20、30代重组病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于该重组火鸡疱疹病毒携带在CMV启动子序列控制下的鸡新城疫病毒的F基因的表达盒，该表达盒的基因序列如Seq ID No:1所示，该病毒被命名为重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)rHVT‑F株，并已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.13396。

【技术特征摘要】
1.一株表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于该重组火鸡疱疹病毒携带在CMV启动子序列控制下的鸡新城疫病毒的F基因的表达盒，该表达盒的基因序列如SeqIDNo:1所示，该病毒被命名为重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirusofturkey,HVT)rHVT-F株，并已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕建敏，
申请(专利权)人：北京邦卓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11