一种抗鸡新城疫病毒的肽核酸及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗鸡新城疫病毒的肽核酸，针对鸡新城疫病毒NDV的HN和M蛋白的基因高度保守区域设计特异性强的两组反义核酸序列，能特异地与NDV的两个关键基因HN和M结合，且分布于NDV基因组的不同区域，该序列与上述靶基因反向互补，根据碱基互补原理，反义核酸序列特异性地与NDV(HN和M)的对应的靶基因相结合，诱导核酶等分子对靶基因进行降解，阻断靶基因的转录与表达，抑制NDV在宿主体内复制与装配，以达到防控鸡新城疫病毒的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于防控鸡新城疫病毒(NDV)的特异性抗病毒肽核酸(反义寡核苷酸)，尤其是涉及含有该反义核酸序列的药物组合物，及其在动物药物上的用途。
技术介绍
新城疫(NewcastleDisease，ND)由新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)感染引起的一种以呼吸道、消化道粘膜出血为典型病变的高度接触性、急性败血性禽类传染病。该病毒主感染鸡、珠鸡和火鸡等，最少有200多种鸟能够被感染，成为目前危害世界养禽业的极易传染的两大毁灭性疾病之一。ND对感染禽类的危害极为严重，因而世界各国均对其采取严格防范措施。被国际兽疫局OIE列为对畜禽危害最大的A类传染病之一。自1926年从印度瓜哇分离到NDV以来，NDV曾在世界范围内造成4次大规模的流行。首次大暴发起源于东南亚和英国，持续时间从1926到1960年，历时近30年，此次流行主要由基因Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型引起，该毒株未流入美国。随着NDV疫苗的广泛使用,此次大流行逐渐平息。第二次大流行始于20世纪60年代的远东，此次大流行主要由基因Ⅴ型和Ⅵ型引起，在短短的4年时间便由南美洲和印尼传入欧美等国家和地区，引起全球流行，主要原因与畜禽国际贸易密切相关。第三次流行始于1974年前后，疫源地尚无定论现在大多数学者认为是由鸽源新城疫病毒引起的。第四次流行发生于亚洲、中东、非洲、南美和欧洲，并一直流传至今，此次流行主要由新基因Ⅶ型引起的。特别是20世纪90年代后期，该病在世界范围内对养禽业造成了巨大的损失。介于ND自然宿主众多，流行范围广，因而对禽类养殖业危害严重，加上大老规模的强制使用疫苗，在临床上该病毒常表现为非典型症状。目前国内外兽医面研究人员对NDV的流行特点及趋势的研究极为关注。关于国内ND的研究，1928年在我国已有记载，1935年在我国部分地区出现流行，40年代分离到国内标准强毒株(F48E8/F48E9株)。ND也是我国禽病中最为烈性的传染病之一，也曾经出现过4次大流行，且在我国许多地区每年都有流行，损失巨大。80年代前后预防接种工作已在养禽业中广泛推广，疫苗的广泛使用收到了良好的效果，许多省区基本上控制了这种疫病。但我国养殖环境复杂，集约化程度仍然不高，疫苗的使用效果仍不够理想。过去认为NDV可以感染水禽但并不致病，但自1997年在华南和华东地区分离到对鹅具有致病性的强毒株后，各地相继分离到对水禽具有高致病性的毒株。在我国，鸡与水禽长期混养，这种混养模式为病毒的相互传播提供良好的宿主环境。近年来，该病随着经济的发展和交往的频繁，新城疫的流行又有抬头的趋势，而且又具有了新的特点，许多地方检测到非典型新城疫，其造成的经济损失不言而喻。同时，目前NDV疫苗使用情况不规范，出现中毒、弱毒、灭活疫苗同时使用情况，这给防控ND带来极大困难，因而开发针对NDV的新型防控药物与措施显得尤为重要。NDV的毒力千差万别，毒力变化机制极为复杂，可以由强变弱，也能够由弱变强，变异趋势引起禽病专家高度关注，这也是研究新型药物所必须考虑的。NDV属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)，副粘病毒属。完整的病毒粒子近似球形，直径120～300nm，NDV病毒粒子内部为一直径约17nm的卷曲的核衣壳(由蛋白质相连结的单股RNA所形成)，其内带有RNA依赖的RNA聚合酶，外面包有脂质双层囊膜。其内层衬有一层特殊的M蛋白，囊膜的外层为具有纤突(8～12nm)的糖蛋白所覆盖,它们分别是具有血凝素和神经氨酸酶活性的HN蛋白和具有融合功能的F蛋白，HN和F蛋白与病毒的毒力有关。典型的NDV为单股负链RNA病毒，整个基因组全长15586个核苷酸(经典的新城疫病毒基因组长度为15186个nt，如LaSota和V4毒株等)，编码6种结构蛋白，即核衣壳蛋白(Np)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶(HN)及RNA聚合酶(L)，各蛋白在基因组上顺序为3’—NP—P—M—F—HN—L—5’。Collins等研究表明，在NDV感染细胞的胞浆中，病毒基因组RNA转录出三组mRNA，沉降系数分别18s、22～28s和35s。其中18sRNA包括5种3’端聚腺苷酸化的mRNA，分别编码NP、P、M、HN和F5种病毒结构成分；35sRNA仅含单一编码L的信息。Nothern杂交试验显示，18s和35sRNA已经包含了整个基因组的遗传信息，其中22～28sRNA含有18sRNA的序列，可能是共价结合的18sRNA。在各基因间有一个3’-GAA保守序列。NDVmRNA在各组mRNA之前均有一个保守的起始信号3’-UGCCCAUCUU-5’,且每一基因末端含有转录的终止信号序列,即3’-AUUCUUUUUU5’序列和mRNA互补的polyA。mRNA的起始信号和polyA之间的距离不等通常在1～47个核苷酸之间。M蛋白，NDV的M蛋白是一个由346个氨基酸组成的多肽，分子量为39.7kDa，基因长度为1241bp，有一个开放阅读框架。转录起始信号也是ACGGGTAGAA，翻译起始于ATG，终止于TAA。M蛋白是非糖蛋白，位于病毒囊膜内侧面，一部分镶嵌在囊膜内，另一部分与核衣壳相邻，共同构成囊膜的支架。M蛋白至少有两个功能区：一为是蛋白质在脂质双层上的嵌合部位；二为区域与病毒核心中的核衣壳结构相互作用有关。M蛋白有多种功能，1).通过与细胞膜、病毒糖蛋白的胞质区以及核衣壳的相互作用而参与病毒的装配过程，进而对形成具有感染性的病毒粒子至关重要，对于M蛋白发生突变的NDV毒株，可能由于不能将F蛋白有效地组装入病毒粒子而失去其感染能力；2).具有抑制宿主细胞RNA转录和蛋白质合成的作用而与病毒的致病性相关。NDV感染早期细胞核内就有M蛋白存在，并在核内和细胞核物质结合，影响正常的基因复制和表达。M蛋白在细胞核中的定位不需要NDV其他蛋白质的参与。目前普遍认为M蛋白与病毒囊膜和核衣壳都有互相作用，但是没有发现它有广泛的疏水区域,最长的中性或疏水序列只有12个氨基酸之多，该序列开始于第55位残基。另有研究显示，M蛋白的序列与其他副粘病毒的M蛋白同源性较小，与Sendai病毒M蛋白只有17％同源性，与VSVM蛋白同源性也较小，只是在N端的111～127位残基处有17个残基同源性较高(64％)。HN蛋白，NDV的HN基因长度为2031bp,约占基因组的13.5％，基因序列中含有一个长的开放阅读框架，因终止密码位置的差异,其翻译的多肽链长短不一。第一类HN的多肽链长616个Aa，为无活性的前体(HN0)，代表株有D26/76等，主要是弱毒株；第二类HN的多肽链长577个Aa，为有生物活性的蛋白，代表株有B1/47等；第三类HN也具有生物学活性，多肽链长571个Aa，代表株有AUS/32等。HN蛋白，即血凝素—神经氨酸酶，是NDV除F蛋白之外，另一种较大的糖蛋白。成熟的HN是一种四聚体寡聚蛋白，亚单位之间通过二硫键相联形成二聚体，两个二聚体非共价结合形成四聚体，HN蛋白具有血球凝集(HA)和神经氨酸酶(NA)两种活性。血凝素成分负责病毒吸附到易感细胞含唾液酸的受体，这是病毒感染细胞的关键第一步。NDV的感染可被HN单抗和单特异性HN糖蛋白抗血清所中和。神经本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗鸡新城疫病毒的肽核酸，其特征是针对鸡新城疫病毒NDV的HN和M蛋白的基因高度保守区域设计特异性强的两组反义核酸序列，能特异地与NDV的两个关键基因HN和M结合，且分布于NDV基因组的不同区域，以下为本专利技术所涉及的一系列序列或其组合：第一组反义核酸序列HN：HN‑1：5’‑CAUUACUAUUAAAAGUAAGACUG‑3’HN‑2：5’‑CAUGGUAUUGACCGUCAAAUCCU‑3’HN‑3：5’‑GGAUAUUUCUGCAAUACUAAGAC‑3’第二组反义核酸序列M：M‑1：5’‑UCAAAGUACAGCCCGAUUGUCCU‑3’M‑2：5’‑ACAUCAAUAGUGACAUUGAGCGC‑3’M‑3：5’‑GGACAUAAGCCCGAUAUGCAGAA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种抗鸡新城疫病毒的肽核酸，其特征是针对鸡新城疫病毒NDV的HN和M蛋白的基因高度保守区域设计特异性强的两组反义核酸序列，能特异地与NDV的两个关键基因HN和M结合，且分布于NDV基因组的不同区域，以下为本发明所涉及的一系列序列或其组合：第一组反义核酸序列HN：HN-1：5’-CAUUACUAUUAAAAGUAAGACUG-3’HN-2：5’-CAUGGUAUUGACCGUCAAAUCCU-3’HN-3：5’-GGAUAUUUCUGCAAUACUAAGAC-3’第二组反义核酸序列M：M-1：5’-UCAAAGUACAGCCCGAUUGUCCU-3’M-2：5’-ACAUCAAUAGUGACAUUGAGCGC-3’M-3：5’-GGACAUA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张则斌，韩健宝，范建华，徐步，张敬峰，徐孝宙，马国辅，黎先伟，王远孝，曲向阳，
申请(专利权)人：张则斌，韩健宝，
类型：发明
国别省市：江苏;32