一种基于DNA芯片的数字化定量检测核酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于DNA芯片的数字化定量检测核酸的方法，通过在基片上固定有扩增引物，通过单个核酸分子模版扩增目标核酸，标记探针与扩增核酸杂交检测标记基团上的信息，或者通过微测序方法读出扩增核酸分子信息，便可读出每一个克隆点的信号，每个信号点就代表原始目标DNA分子的数量，统计信号点数量计算出该核酸的数量。为核酸分子定量分析提供一种新方法，建立快速，准确，便宜的核酸检测技术。

【技术实现步骤摘要】
—种基于DNA芯片的数字化定量检测核酸的方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种基于DNA芯片的数字化定量检测核酸的方法。
技术介绍
一切生命组成都离不开蛋白质，而蛋白质是由核酸编码的，因此核酸可以说是生命的基础。核酸(如DNA)包含着所有生物机体的蓝图，对核酸序列的研究对生命科学至关重要。随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。人们在对核酸的研究过程中，除了关注它的序列、突变等一些定性的方面以夕卜，还要关注它的量，因为生物体内各种基因mRNA量的变化，会导致翻译出的蛋白质数量的改变，最终发生病理变化。故测定mRNA的量可以判断生理病理变化情况。同样，在临床上，通过检测病毒基因的数量，可以判断病毒的复制情况。而基因表达研究、药物筛选、药效学评价和致病基因检测诊断等也需要对核酸进行定量检测。因此，在分子生物学和生物医学中基因的定量检测具有重要意义。 传统的核酸定量方法，如化学发光法、分子光谱分析法以及电化学分析法由于在定量分析上准确度差而且无法对微量样本做出分析，已不适应如今快速发展的结构分子生物学、基因组学、蛋白质组学、生物技术药物代谢动力学等新兴生命科学分支的要求。取而代之的是近年发展起来的具有高灵敏度、高通量和具有自动化分析能力的核酸定量方法，如:定量聚合酶链式反应技术、基因表达系列分析(Serial Analysis ofExpress1n, SAGE)、微阵列技术(Microarrays)。 随着高量测序技术的应用，对核酸定量分析要求越来越高，目前这些核酸检测技术，都难以达到数字化精确检测水平。如果用这些相对落后的定量检测技术对目前先进的测序数据进行定量分析，明显不能满足要求。本专利技术的目的就是通过在基片上直接进行单分子扩增技术，然后检测扩增产物达到对核酸数字化定量分析。为核酸的定量分析提供一种新方法，建立快速，准确，便宜的核酸定量分析技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于DNA芯片的数字化定量检测核酸的方法，该方法利用每个模板DNA分子经过固相扩增后都得到了大量的分子，对这些分子的检测很容易利用目前的荧光探针或微测序技术检测，达到绝对定量检测DNA目的。 本专利技术通过以下技术方案实现: —种基于DNA芯片的数字化定量检测核酸的方法，在核酸的数字化定量检测是通过在基片上固定有扩增引物，通过单个核酸分子模版扩增目标核酸，标记探针与扩增核酸杂交检测标记基团上的信息，或者通过微测序方法读出扩增核酸分子信息，统计信号点数量计算出该核酸的数量。 本专利技术所述的检测核酸的方法，检测对像核酸为脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA。 本专利技术所述的检测核酸的方法，所述的基片分成一个或一个以上的分区，每一个分区固定有一种引物，各区域的引物序列相同或不相同，所述的分区可以采用物理分区，即把引物固定时，每一个区域都隔开一定距离。 本专利技术所述的检测核酸的方法，所述的单个模版核酸分子含有与固定在基片上的一个引物序列互补配对的一段序列，含有与目标核酸上相邻两段碱基序列互补配对的两段序列，含有与标记探针上一段碱基序列互补配对的一段序列。 本专利技术所述的检测核酸的方法，未知单链DNA模板位于溶液、平面基片、96或384孔板或修饰的珠子上，未知单链DNA模板通过常规的PCR，滚环扩增、固相扩增、桥式扩增以及固相酶连接反应增加其分析用数量，扩增可以是单重的，即一次扩增一个目的片断，或者是多重的，即一次扩增多个目的片断。 本专利技术所述的检测核酸的方法，定量检测DNA模板数量为一个或多个同时进行。 本专利技术的有益效果为:1)本专利技术的最大优点是实现对核酸分子的数字化定量分析，由于模板核酸分子通过引物固定在DNA芯片上进行固相扩增，得到的分子量大，对这些分子的检测很容易利用目前的荧光探针或微测序技术检测，所以操作简单、可行性高；2)本专利技术的所需要的试剂和仪器均为常用，无需特殊购买，相比较传统的数字化定量检测核酸的方法PCR而言，扩增效率特异性高，节省扩增时间，避免了热循环对扩增的影响。 【附图说明】 图1是用于连接成环的DNA序列结构示意图； 图2是图1所示序列在连接酶体系和模板e ； 图3是图1所示序列在连接酶体系和模板e连接成闭环结构； 图4是固定有引物序列的DNA芯片； 图5是DNA聚合酶及其反应体系和图3的闭环DNA存在下进行滚环扩增后图示； 图6是突光标记探针识别图示。 【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的
技术实现思路
加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本专利技术的保护范围内。 实例I荧光探针杂交法检测疼痛相关基因BDNF在VTA区的表达 设计以下序列: Bdnf-P:5’ P-GCGTGCAAATTG CCCTATAGTGAGTCGTATTACTATAGTGTCACCGGCAAAGGATCG3，； Gapdh-P:5’ P GTTATCGTGTAGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTTAGTCACTACTGCACAACTGGTT3，； IM-primer:5’ amino_TTTTTTTTTTTTTTAATACGACTCACTATAGGG3’ ； Probel:5’ cy3_CTATAGTGTCACC3’ ； Probe2:5， cy5_GTTAGTCACTACT3，； T18:TTTTTTTTTTTTTTTTTT。 提取小鼠VTA区总RNA，利用反转录引物T18及反转录试剂盒，把RNA转为cDNA。在连接反应体系中加入反转录好的cDNA，Bdnf-P和Gapdh-P混合在一起进行连接反应使Bdnf-P和Gapdh-P连接成环状单链DNA (此时环状单链DNA的量就代表着cDNA模板量的多少)；同时制备醒基修饰的DNA芯片,把氨基修饰的引物IM-primer固定到醒基修饰的DNA芯片上(可以按照成熟的传统DNA芯片制备方法获得，也可以通过商业途径获得)；phi29DNA聚合酶(也可以选用Bst DNA聚合酶)以及相应的反应体系中加入之前连接产物作为模板，在芯片上进行单分子固相扩增。然后利用Probel和Probe2探针进行杂交，在芯片扫描仪或共聚焦显微镜下观察荧光，Probel所携带荧光cy3信号代表Bdnf基因在VTA区的表达量，Probe2所携带荧光cy5信号代表Gapdh基因在VTA区的表达量，计算荧光点数目即为BDNF和GAPDH基因的表达量。 实例2微测序法检测疼痛相关基因BDNF，NNAT以及内参基因GAPDH在VTA区的表达。 设计以下序列: Bdnf-P:5’ P-GCGTGCAAATTG CCCTATAGTGAGTCGTATTACTATAGTGTCACCGGCAAAGGATCG3，； Gapdh-P:5’ PGTTATCGTGTAGCCCTATAGTGAGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于DNA芯片的数字化定量检测核酸的方法，其特征在于：通过在基片上固定有扩增引物，通过单个核酸分子模版扩增目标核酸，标记探针与扩增核酸杂交检测标记基团上的信息，或者通过微测序方法读出扩增核酸分子信息，统计信号点数量计算出该核酸的数量。

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA芯片的数字化定量检测核酸的方法，其特征在于:通过在基片上固定有扩增引物，通过单个核酸分子模版扩增目标核酸，标记探针与扩增核酸杂交检测标记基团上的信息，或者通过微测序方法读出扩增核酸分子信息，统计信号点数量计算出该核酸的数量。2.根据权利要求1所述的检测核酸的方法，其特征在于:该方法检测对像核酸为脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA。3.根据权利要求1所述的检测核酸的方法，其特征在于:所述的基片分成一个或一个以上的分区，每一个分区固定有一种引物，各区域的引物序列相同或不相同。4.根据权利要求1所述的检测核酸的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：李燕强，韩文灿，潘志强，夏静，许可，
申请(专利权)人：徐州医学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32