基于核酸序列编码的ELISA检测芯片及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于核酸序列编码的ELISA检测芯片及其制备和应用；所述芯片的制备包括将编码核酸、捕获分子固定在微纳米珠表面形成微纳米珠复合物的步骤、在所得微纳米珠复合物表面固定靶向标志物、带有标记的检测分子形成微纳米珠复合体的步骤、将所得微纳米珠复合体装载至分布有微纳米坑阵列的基底上制备ELISA检测芯片的步骤以及ELISA检测和编码核酸解码步骤。与现有技术相比，本发明专利技术可在一张芯片上同时检测海量样品及多种标志物，ELISA检测在微纳米坑内进行，反应体积可小于10‑24L级，可大大降低试剂用量。本发明专利技术可广泛用于临床医学检测、献血者检测、体检、农副产品毒素、非法食品添加物及环境污染的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物芯片技术，具体是一种基于核酸序列编码的ELISA检测芯片及其制备和应用，即具体是一种经核酸序列编码的酶联免疫吸附反应(简称ELISA)芯片的制作与检测方法，可在一张芯片上同时检测多个样品和多个靶向标志物，检测样品数×标志物数的总量可高达百万以上。不仅通量高，还能大幅度节省耗材。在医学领域，可实现疾病的早期检测与诊断，为预防和治疗提供足够时间，还可用于环境污染检测以及农副产品的农药残留、兽药残留、生物毒素和非法食品添加物等检测。
技术介绍
在生物芯片制作和使用过程中，编码(encode、encoded或encoding)技术，也称条形码(barcode、barcoded或barcoding)技术，可以在一张芯片上同时检测多来源样品的多个标志物，最后，芯片中的每个样点，可以通过解码而追溯到各个标志物及其样品的来源，能大幅度提高生物芯片的并行化检测水平。目前，这种编码技术已应用于DNA测序领域。但是，在以蛋白质及其他核酸以外物质为标志物的药物筛选、新药发现、疾病早期诊断、食品安全和环境污染等检查中，还缺乏这种与DNA检测相类似的编码技术。经对现有文献检索发现，2002年，KevinBraeckmans等在NatureReviewsDrugDiscovery(第1卷，第6期，第447-456页)发表了题为“Encodingmicrocarriers:Presentandfuturetechnologies”论文，综述了几种已发表的微米珠编码方法，主要有光(质)谱编码、电子编码、图形编码和物理编码。这些技术均存在一种或多种限制，例如，编码数量少、操作简便性差和检测通量低。本专利技术要解决的是一种编码量几乎无限、可在一张芯片上同时检测多来源样品和多靶向标志物的核酸序列编码微纳米珠的ELISA芯片的制作与检测方法。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于核酸序列编码的ELISA检测芯片及其制备和应用，即提供一种新的核酸序列编码微纳米珠的ELISA芯片的制作与检测技术，同时检测多样品的多个标志物。本专利技术的目的是通过如下所述的技术方案实现的：1、微纳米珠编码：用活性基团修饰也称包被微纳米珠，根据待检样品数(X)和每个样品的待检靶向标志物数(Y)，将微纳米珠分为N份，其中N＝(X+对照)×Y，据此设计并合成N种带有序列独特编码区的核酸，核酸用可与微纳米珠表面活性基团发生连接反应的活性基团修饰，将每一种序列连接到一份微纳米珠表面，清洗并纯化，直至完成N份微纳米珠的编码，将微纳米珠划分为(X+对照)组，每组Y份，记载、备用。如果微纳米珠表面的活性基团既用于固定编码核酸，又用于后续ELISA的分子固定时，在固定编码核酸分子时，使编码核酸分子数少于微纳米珠表面的活性基团数，便于留有足够的活性基团用于后续ELISA的分子固定。2、ELISA样品制备：ELISA检测有多种体系，主要包括：①双抗体夹心法：当靶向标志物为大分子抗原时，即具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。这时首先向微纳米珠表面固定已知抗体A，利用待测抗原上两个抗原决定簇A’和B’分别与固定在载体上(对于本专利技术来讲此处的载体即指微纳米珠)的抗体A和标记的第二个抗体B结合，后者也称为二抗，形成“固定的抗体A-待测抗原-标记检测抗体B”复合物，该复合物的抗体标记，一般采用可催化底物发生某种颜色改变的酶，这时称为酶标检测抗体，形成复合物后，再添加酶底物，酶催化显色反应后，光学检测；如果这里的标记是荧光团或荧光分子时，则不需添加底物而靠荧光团发光检测，下同。②双抗原夹心法，与双抗体夹心法类似，所不同的是形成“固定的已知抗原-待测抗体-标记检测抗原”复合物，最后添加酶底物检测。③间接法：形成“抗原(或半抗原)-待测抗体-标记检测二抗”复合物，再添加酶底物检测；④直接竞争法：有直接竞争法I，固定的已知抗体，同时添加待测抗原和标记检测抗原，再加底物显色；直接竞争法II，固定已知抗原，同时添加待测抗原和酶标检测抗体，再加底物显色；⑤间接竞争法：固定已知抗原，同时添加已知抗体和待测抗原，再加入标记检测二抗，然后加底物显色；⑥捕获法：固定抗人IgM抗体，捕获待测IgM抗体，IgM抗体再结合特异抗原，加入酶标二抗检测。无论上述哪种格式，这里将首先固定到微纳米珠表面的分子统称为捕获分子。将Y种捕获分子分别固定到每组Y份的微纳米珠上，直至完成(X+对照)组的捕获分子固定；用封阻溶液封阻微纳米珠表面可能剩余的活性基团，清洗纯化，除对照外，将组内Y种微纳米珠混合，备用。采用不同ELISA体系时，后续步骤略有不同，当采用①双抗体夹心法、②双抗原夹心法和③间接法时，每个样品溶液和对照，分别与微纳米珠反应，清洗后与标记检测分子反应，清洗；采用④直接竞争法时，直接竞争法I：标记检测抗原分别与待测样品及对照溶液等量混合后与微纳米珠反应，清洗；直接竞争法II：标记检测抗体分别与待测样品及对照溶液等量混合后与微纳米珠反应，清洗：采用⑤间接竞争法时，已知抗体和待测样品(含对照)，等量混合后与微纳米珠反应，清洗后再加入标记检测二抗，清洗后备用。采用⑥捕获法时，待测样品及对照与微纳米珠反应，再加特异抗原后，加入标记检测二抗，清洗。3、微纳米坑基底的制备：用微纳加工方法，在固相基底上制备微纳米坑阵列。4、编码ELISA芯片的制备与检测：将上述制备的微纳米珠装载到微纳米坑阵列基片中，除去基片表面未装载的自由微纳米珠，形成检测芯片；将检测芯片置放到设有进、出样口的微流室中并密封，从微流室进样口向微纳米坑阵列添加酶底物溶液，光学显微镜检测并记录结果，之后清洗；少数情况下，检测分子上的酶标记用荧光团替代，这时无需添加底物，可直接光学检测。5、微纳米珠解码：去除上步ELISA检测留下的荧光后，用DNA测序方法测序每个微纳米珠上编码核酸的序列，完成解码。根据解码结果，将微纳米坑内的检测结果追踪到具体样品的具体靶向标志物。所述技术方案具体实施如下：第一方面，本专利技术提供一种基于核酸序列编码的ELISA检测芯片的制备方法，包括将编码核酸、捕获分子固定在微纳米珠表面形成微纳米珠复合物的步骤、在所得微纳米珠复合物表面捕获靶向标志物、带有标记的检测分子形成微纳米珠复合体的步骤，及将所得微纳米珠复合体装载至分布有微纳米坑阵列的基底上制备ELISA检测芯片的步骤。优选地，所述编码核酸为DNA或RNA。本专利技术中所述的带有单链编码核酸序列的核酸，从编码序列的第一个碱基开始，每一个碱基位置，均有4种选择(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于核酸序列编码的ELISA检测芯片的制备方法，其特征在于，包括将编码核酸、捕获分子固定在微纳米珠表面形成微纳米珠复合物的步骤、在所得微纳米珠复合物表面固定靶向标志物、带有标记的检测分子形成微纳米珠复合体的步骤、将所得微纳米珠复合体装载至分布微纳米坑阵列的基底上制备ELISA检测芯片的步骤。

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸序列编码的ELISA检测芯片的制备方法，其特征在于，包括将编码核
酸、捕获分子固定在微纳米珠表面形成微纳米珠复合物的步骤、在所得微纳米珠复合物表
面固定靶向标志物、带有标记的检测分子形成微纳米珠复合体的步骤、将所得微纳米珠复
合体装载至分布微纳米坑阵列的基底上制备ELISA检测芯片的步骤。
2.根据权利要求1所述的基于核酸序列编码的ELISA检测芯片的制备方法，其特征在
于，所述编码核酸为DNA或RNA，所述编码核酸为线性单链核酸或者呈发卡结构；
所述捕获分子为抗体、抗原或半抗原；
所述微纳米珠的直径在百纳米至数十微米级之间；所述微纳米珠的材质包括有机硅、
磁性材料或多聚物。
3.根据权利要求1或2所述的基于核酸序列编码的ELISA检测芯片的制备方法，其特征
在于，所述编码核酸、捕获分子的固定具体是通过所述微纳米珠表面携带的活性基团和修
饰核酸、捕获分子的活性基团发生反应形成活性基团对实现的。
4.根据权利要求1所述的基于核酸序列编码的ELISA检测芯片的制备方法，其特征在
于，所述检测分子为抗体或者抗原；所述标记为酶或者荧光分子。
5.根据权利要求1所述的基于核酸序列编码的ELISA检测芯片的制备方法，其特征在
于，微纳米珠复合体的制备步骤中，所述靶向标志物、带标记的检测分子的固定步骤依据所
采用ELISA体系的不同而不同；其中，所述ELISA体系为①双抗体夹心法、②双抗原夹心法、
③间接法、④直接竞争法、⑤间接竞争法、⑥捕获法中的一种。
6....

【专利技术属性】
技术研发人员：王志民，侯彩玲，何珊珊，王媛媛，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31