多个核酸靶标的分析方法技术

本公开提供即使同时检测的核酸靶标的种类增加，检测荧光的光学系统也不变得复杂，能通过小型、廉价的构成分析多个核酸靶标的方法。本公开涉及的检测装置具备PCR处理部、边界检测部和检测部，所述PCR处理部对在流路中流淌的第1液滴至第4液滴进行PCR处理，所述边界检测部检测从PCR处理后的第1液滴至第4液滴输出的荧光强度，并基于荧光强度，获得在第5流路中流淌的第1液滴至第4液滴各自之间的边界，所述检测部基于荧光强度和第1液滴至第4液滴各自之间的边界，获得具有第1阈值以上的荧光强度的第2液滴和第4液滴的数，并基于第2液滴和第4液滴的数检测对象核酸靶标中是否包含选自第1核酸靶标和第2核酸靶标中的至少1种。

【技术实现步骤摘要】

本公开涉及核酸靶标的分析方法。
技术介绍
作为用于实现核酸靶标分析的基本技术，一般采用以下方法：使用称为PCR(聚合酶链反应)的技术，使DNA、RNA等的核酸中的所希望的核酸靶标扩增至检测所需的量，进行检测。另外，作为其发展形式，一般使用称为qPCR(定量PCR，quantitative PCR)的定量分析技术。这些核酸靶标的定量分析技术被导入到微流路芯片内的小型反应器等中。专利文献1中关于对基因进行定量分析的qPCR记载了基本的实现方法。该专利文献1中记载了以下方法：使包含单链DNA的样品，与具有靶标DNA的序列链的第一区域的互补序列的寡核苷酸(长度较短的DNA/RNA的序列)、以及包含相同靶标DNA的序列链的第二区域的互补序列的标记寡核苷酸接触，在发生杂交的条件下形成双链复合体的混合物，通过5’→3’核酸酶活性来切断退火后的标记寡核苷酸而使标记片段游离，检测该游离的标记片段。作为标记寡核苷酸的标记片段，如果使用荧光色素和猝灭剂，则在标记片段游离时才发出荧光，因而通过重复上述工艺，荧光强度越来越强。一般地，发生杂交的条件、产生核酸酶活性的条件等，可通过使样本暴露于一定温度条件来实现。即，重复上述工艺，是指对样本重复规定的温度的升高降低(温度循环)。通过用光检测器来检测该荧光强度的强弱，调整上述工艺的重复次数(温度循环的次数)与荧光强度的强弱的关系，可以分析以怎样的程度含有靶标DNA的所希望的序列链。在对每一样本检测多个部位的靶标的情况下，准备与各个序列链互补的标记
寡核苷酸，通过使每个标记寡核苷酸的成为标记的荧光色素的材料、波长不同，可以在光检测器中根据荧光波长的差进行分离分析。另外，专利文献2中对于对基因进行定量分析的方法公开了实现方法的一例。特别是公开了使用了乳化技术的高通量检定的改善技术。该方法使用乳化技术，制作出作为生化反应用的独立的反应腔室发挥功能的液滴，使用这些液滴来对各个亚成分(细胞、核酸、蛋白质等)进行处理、检查。使包含DNA/RNA等的水滴在油中悬浮，能够制作水进入油中的状态的乳剂。用表面活性剂使该乳剂稳定化，能够使加热、冷却、运输中的液滴的结合减少或消失，由此能够实施在PCR技术等中进行的温度循环。因此，利用了PCR的液滴中的核酸靶标分子的单拷贝扩增使用乳剂来实施。基于泊松统计来分析这些液滴内对某个靶标为阳性的液滴，能够推定样本中的靶标的浓度。在利用液滴的检定中，使用1种或多种荧光体作为液滴中的标记，从而得知是否发生扩增等反应。通过生成液滴、使其反应、接着测定从各液滴放出的光，从而能够判断液滴中是否存在靶标。如果使能够区分的不同的荧光体分别对应于每个不同的靶标，则能够测定每个液滴中是否存在多个不同的靶标。这样在区别多个不同的靶标的情况下，一般使用以下方法：使用多种荧光体、即发出不同波长的荧光的色素材料，根据其荧光波长来区别。在专利文献2中，公开了使用2种荧光色素，各自区别地检测的方法。设计分别对应于第1色素、第2色素的检测构成(包含光源和检测器)，在液滴通过流路的检测区域时，用对应于第1色素的检测构成和对应于第2色素的检测构成交互地检测液滴，从而实现。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特许第2825976号公报专利文献2：日本特表2013-524169号公报
技术实现思路
专利技术所要解决的课题然而在现有的构成中，在DNA/RNA等核酸中同时检测作为目标的多个核酸靶标时，需要准备具有与各个核酸靶标的碱基序列互补的碱基序列的引物、探针等的反应药液，将修饰引物、探针等的荧光色素对每个核酸靶标分别变更，从而进行分离检测。另外，需要用于激发各个荧光色素的光源、用于检测各个荧光色素的荧光波长的光学系统。存在随着同时检测的核酸靶标的种类增加，对应的荧光色素的准备、检测荧光的光学系统变得复杂的课题。本公开的目的在于提供在同时检测的核酸靶标的种类增加的情况下，检测荧光的光学系统也不变得复杂的、通过小型、廉价的构成来分析多个核酸靶标的方法。用于解决课题的技术方案本公开的使用微流路芯片来检测第1核酸靶标和第2核酸靶标的检测方法包括：(a)在检测装置中设置微流路芯片，所述检测装置具备PCR处理部、PCR反应器、荧光检测部和检测电路，所述微流路芯片具备第1流路、第2流路、第3流路、第4流路和第5流路，所述第1流路的一端、所述第2流路的一端以及所述第3流路的一端与所述第4流路连接，所述PCR反应器位于所述第4流路和所述第5流路的之间，(b)通过(ⅰ)从所述第1流路的另一端依次供给第1水溶液、第1油和第2水溶液，(ⅱ)从所述第2流路的另一端供给样品水溶液，和(ⅲ)从所述第3流路的另一端供给第2油，从而使由所述第1水溶液和所述样品水溶液组成的第1液滴、由所述样品水溶液组成的第2液滴、由所述第2水溶液和所述样品水溶液组成的第3液滴以及由所述样品水溶液组成的第4液滴依次通过所述第4流路，其中，所述第1水溶液具有第1DNA，所述第1DNA具有与所述第1核酸靶标互补的序列、并且被第1荧光色素修饰，所述第2水溶液具有第2DNA，所述第2DNA具有与所述第2核酸靶标互补的序列、并且被第2荧光色素修饰，(c)将通过所述第4流路到达所述PCR反应器的所述第1液滴至所述第4液滴，通过所述PCR处理部进行PCR处理，使所述PCR处理后的所述第1液滴至所述第4液滴通过所述第5流路，(d)所述第1液滴至所述第4液滴在所述第5流路中流淌时，通过所述荧光检测部，检测从所述第1液滴至所述第4液滴输出的荧光强度，(e)基于所述荧光强度，获得在所述第5流路中流淌的所述第1液滴至所述第4液滴各自之间的边界，(f)通过所述检测电路，基于所述荧光强度、和所述第1液滴至所述第4液滴各自之间的边界，获得具有第1阈值以上的荧光强度的所述第2液滴和所述第4液滴的数量，并且基于所述第2液滴和所述第4液滴的数量，检测所述样品水溶液中是否包含选自所述第1核酸靶标和所述第2核酸靶标中的至少1种。专利技术的效果根据本公开的多个核酸靶标的分析方法，在同时检测的核酸靶标增加的情况下，也能够不使微流路芯片的流路构成复杂化，另外，可以使用同一波长的修饰与核酸靶标一对一地反应的反应药液的荧光色素，因此检测荧光的光波导单元能够以简单的构成实现。由此，能够提供小型且廉价的装置构成。附图说明图1的上层是显示在微流路芯片的光波导单元的一支流路中流通的多个液滴群的概略图，下层是显示对于多个液滴群测量的输出信号的一例的图。图2是显示反应药液库的构成的一例的概略图。图3A是切下实施方式1所涉及的微流路芯片的流路的一部分的剖面后的立体图。图3B是显示微流路芯片的构成的一例的概略图。图4A是显示实施方式1中的流路合流部的构成的一例的概略图。图4B是显示实施方式1中的流路合流部的构成的一例的概略图。图5是显示PCR用反应器的构成的一例的概略图。图6A是显示使用了TaqMan探针的PCR的各过程的概略图。图6B是显示使用了TaqMan探针的PCR的各过程的概略图。图6C是显示使用了TaqMan探针的PCR的各过程的概略图。图7是显示实施方式1中的微流路芯片的光波导单元和核酸靶标分析装置的光学系统的构成的一例的概略图。图8的上层是显示在微流路芯片的光波导单元的一支流路中流通的多本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测方法，是使用微流路芯片来检测第1核酸靶标和第2核酸靶标的检测方法，包括：(a)在检测装置中设置微流路芯片，所述检测装置具备PCR处理部、PCR反应器、荧光检测部和检测电路，所述微流路芯片具备第1流路、第2流路、第3流路、第4流路和第5流路，所述第1流路的一端、所述第2流路的一端以及所述第3流路的一端与所述第4流路连接，所述PCR反应器位于所述第4流路和所述第5流路的之间，(b)通过(ⅰ)从所述第1流路的另一端依次供给第1水溶液、第1油和第2水溶液，(ⅱ)从所述第2流路的另一端供给样品水溶液，和(ⅲ)从所述第3流路的另一端供给第2油，从而使由所述第1水溶液和所述样品水溶液组成的第1液滴、由所述样品水溶液组成的第2液滴、由所述第2水溶液和所述样品水溶液组成的第3液滴以及由所述样品水溶液组成的第4液滴依次通过所述第4流路，其中，所述第1水溶液具有第1DNA，所述第1DNA具有与所述第1核酸靶标互补的序列、并且被第1荧光色素修饰，所述第2水溶液具有第2DNA，所述第2DNA具有与所述第2核酸靶标互补的序列、并且被第2荧光色素修饰，(c)将通过所述第4流路到达所述PCR反应器的所述第1液滴至所述第4液滴，通过所述PCR处理部进行PCR处理，使所述PCR处理后的所述第1液滴至所述第4液滴通过所述第5流路，(d)所述第1液滴至所述第4液滴在所述第5流路中流淌时，通过所述荧光检测部，检测从所述第1液滴至所述第4液滴输出的荧光强度，(e)基于所述荧光强度，获得在所述第5流路中流淌的所述第1液滴至所述第4液滴各自之间的边界，(f)通过所述检测电路，基于所述荧光强度、和所述第1液滴至所述第4液滴各自之间的边界，获得具有第1阈值以上的荧光强度的所述第2液滴和所述第4液滴的数量，并且基于所述第2液滴和所述第4液滴的数量，检测所述样品水溶液中是否包含选自所述第1核酸靶标和所述第2核酸靶标中的至少1种。...

【技术特征摘要】
2015.03.10 JP 2015-0475251.一种检测方法，是使用微流路芯片来检测第1核酸靶标和第2核酸靶标的检测方法，包括：(a)在检测装置中设置微流路芯片，所述检测装置具备PCR处理部、PCR反应器、荧光检测部和检测电路，所述微流路芯片具备第1流路、第2流路、第3流路、第4流路和第5流路，所述第1流路的一端、所述第2流路的一端以及所述第3流路的一端与所述第4流路连接，所述PCR反应器位于所述第4流路和所述第5流路的之间，(b)通过(ⅰ)从所述第1流路的另一端依次供给第1水溶液、第1油和第2水溶液，(ⅱ)从所述第2流路的另一端供给样品水溶液，和(ⅲ)从所述第3流路的另一端供给第2油，从而使由所述第1水溶液和所述样品水溶液组成的第1液滴、由所述样品水溶液组成的第2液滴、由所述第2水溶液和所述样品水溶液组成的第3液滴以及由所述样品水溶液组成的第4液滴依次通过所述第4流路，其中，所述第1水溶液具有第1DNA，所述第1DNA具有与所述第1核酸靶标互补的序列、并且被第1荧光色素修饰，所述第2水溶液具有第2DNA，所述第2DNA具有与所述第2核酸靶标互补的序列、并且被第2荧光色素修饰，(c)将通过所述第4流路到达所述PCR反应器的所述第1液滴至所述第4液滴，通过所述PCR处理部进行PCR处理，使所述PCR处理后的所述第1液滴至所述第4液滴通过所述第5流路，(d)所述第1液滴至所述第4液滴在所述第5流路中流淌时，通过所述荧光检测部，检测从所述第1液滴至所述第4液滴输出的荧光强度，(e)基于所述荧光强度，获得在所述第5流路中流淌的所述第1液滴至所述第4液滴各自之间的边界，(f)通过所述检测电路，基于所述荧光强度、和所述第1液滴至所述第4液滴各自之间的边界，获得具有第1阈值以上的荧光强度的所述第2液滴和所述第4液滴的数量，并且基于所述第2液滴和所述第4液滴的数量，检测所述样品水溶液中是否包含选自所述第1核酸靶标和所述第2核酸靶标中的至少1种。2.根据权利要求1所述的检测方法，在所述工序(b)中，(ⅳ)在所述第1流路中流淌的所述第1水溶液、所述第1油和所述第2水溶液的流速，(ⅴ)在所述第2流路中流淌的所述样品水溶液的流速，以及(ⅵ)在所述第3流路中流淌的所述第2油的流速是一定的。3.根据权利要求1所述的检测方法，所述第4流路的一端与所述第1流路的一端、所述第2流路的一端以及所述第3流路的一端连接。4.根据权利要求1所述的检测方法，所述第4流路的一端与所述第1流路的一端以及所述第2流路的一端连接，所述第3流路的一端与所述第4流路的所述一端和另一端之间连接。5.根据权利要求1所述的检测方法，在所述工序(d)中检测多个荧光强度的变化，其中，所述多个荧光强度的变化是第2阈值以上的所述荧光强度的变化，在所述工序(e)中，基于各个检测到所述多个荧光强度的变化的位置，作为选自(ⅶ)所述第1液滴与所述第2液滴之间的边界、(ⅷ)所述第2液滴与所述第3液滴之间的边界、(ⅸ)所述第3液滴与所述第4液滴之间的边界和(ⅹ)所述第4液滴与所述第1液滴之间的边界中的至少1个边界而获得，从而获得多个边界。6.根据权利要求5所述的检测方法，所述多个荧光强度的变化包含第1荧光强度的变化和第2荧光强度的变化，在所述工序(e)中，基于检测到所述第1荧光强度的变化的时刻和检测到所述第2荧光强度的变化的时刻之间的时间间隔，确定所述第2液滴和所述第4液滴，从而获得所述第1液滴至所述第4液滴各自之间的边界。7.根据权利要求6所述的检测方法，在所述工序(e)中，在所述时间间隔为规定时间以上的情况下，获得与所述第2荧光强度的变化对应的边界，作为(ⅷ)所述第2液滴与所述第3液滴之间的边界或(ⅹ)所述第4液滴与所述第1液滴...

【专利技术属性】
技术研发人员：佃雅彦，
申请(专利权)人：松下知识产权经营株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP