靶核酸的多重分析制造技术

本发明专利技术尤其提供检测靶核酸的方法，其包含以下步骤：a)使样品与各包含至少一个靶捕获序列的一或多个捕获探针在准许所述一或多个捕获探针捕获所述样品中的一或多个靶核酸的条件下接触；b)在包含可检测实体的反应混合物中扩增所捕获的一或多个靶核酸以使得扩增的一或多个靶核酸标记有所述可检测实体；c)用多个再捕获探针培育扩增产物以使得所述扩增的一或多个靶核酸被所述多个再捕获探针再捕获；以及d)检测由与再捕获的扩增的一或多个靶核酸结合的可检测实体产生的信号，其中所述可检测信号的存在和/或丰度指示所述样品中的所述一或多个靶核酸的存在和/或丰度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】革田核酸的多重分析相夫申请 本申请要求2013年4月25日提交的美国临时专利申请第61/816, 070号和2014 年2月6日提交的第61/936, 826号的优先权和权益，所述申请的全部内容W引用的方式并 入本文中。 序列表 根据37CFR1. 52 (e)巧），W文本文件形式的序列表（标题为"SequenceListing, txt"，创建于2014年4月25日，并且大小为5千字节）W全文引用的方式并入本文中。
技术介绍
对于诊断性和治疗性用途来说，核酸变得越来越重要。举例来说，各种核酸生物标 记或患病细胞中存在的基因组突变和不平衡的早期和精确检测可能具有重要的临床意义。 多重技术是分析核酸的强大工具，尤其在实验室和诊断背景中。然而，许多运些方法受非特 异性祀标的较低灵敏度、交叉反应性或分析/仪器复杂性限制。
技术实现思路
本专利技术针对在先技术中存在的常规多重技术所面临的许多限制，并且提供更稳 固、可靠并且有效的分析核酸的方法和系统，所述核酸包括（但不限于）多种微RNA、mRNA、 较长非编码RNA(IncRNA)、基因组DNAW及合成RNA，如单一样品中的siRNA。如本文所描 述，本文所描述的方法和组合物在捕获、分析或定量生物样品中的低丰度祀核酸方面尤其 有效。本文所描述的方法和组合物可W用于分析单一祀核酸或同时分析多个祀核酸。 因此，在一个方面，本专利技术提供检测祀核酸的方法，其包含W下步骤：a)使样品与 各包含至少一个祀捕获序列的一或多个捕获探针在准许一或多个捕获探针捕获样品中的 一或多个祀核酸的条件下接触；b)在包含可检测实体的反应混合物中扩增所捕获的一或 多个祀核酸W使得扩增的一或多个祀核酸标记有可检测实体；C)用多个再捕获探针培育 扩增产物W使得扩增的一或多个祀核酸被多个再捕获探针再捕获；W及d)检测由与再捕 获的扩增的一或多个祀核酸结合的可检测实体产生的信号，其中可检测信号的存在和/或 丰度指示所述样品中的一或多个祀核酸的存在和/或丰度。 在一些实施例中，捕获探针中的每一者包含一种祀捕获序列并且特异性结合到一 种不同祀核酸。在一些实施例中，捕获探针中的每一者包含多种不同祀捕获序列并且结合 到多种不同祀核酸。在一些实施例中，再捕获探针中的每一者包含一种祀捕获序列并且特 异性结合到一种不同祀核酸。在一些实施例中，再捕获探针中的每一者包含多种不同祀捕 获序列并且结合多种不同祀核酸。在一些实施例中，捕获探针和再捕获探针相同。在一些 实施例中，捕获和/或再捕获探针与衬底结合。 在一些实施例中，衬底由选自由W下组成的群组的材料制成：水凝胶、玻璃、光阻 剂、二氧化娃、聚苯乙締、聚乙二醇、琼脂糖、壳聚糖、海藻酸盐、PLGA、光纤、纤维素化及其组 合。在一些实施例中，所述材料是水凝胶。在一些实施例中，所述衬底是图案化平面衬底、 微忍片、塑料、珠粒、生物膜、粒子。在一些实施例中，所述衬底是粒子。在一些实施例中，捕 获或再捕获探针嵌入遍及粒子的一或多个探针区域中。在一些实施例中，所述粒子进一步 包含一或多个编码区域，并且其中所述一或多个编码区域携有提供捕获或再捕获探针的特 性的可检测部分。 在一些实施例中，一或多个祀核酸是微RNA、mRNA、非编码转录物、基因组DNA、 cDNA、siRNA、DNA/RNA嵌合体或其组合。在一些实施例中，所述探针是DNA、RNA、DNA/RNA嵌 合体或其组合。在一些实施例中，对祀核酸具有特异性的探针包含与祀核酸实质上互补的 祀捕获序列。 在一些实施例中，所述方法进一步包含使一或多个衔接子偶联到所捕获的祀核酸 的步骤。在一些实施例中，所述一或多个衔接子是通用衔接子。在一些实施例中，所述一或 多个衔接子在3'端、5'端或3'端和5'端两处偶联到祀核酸。在一些实施例中，所述一或 多个衔接子是DNA、RNA、DNA/RNA嵌合体或其组合。 在一些实施例中，所捕获的祀核酸首先被核酸酶或限制酶消化W在一或多个衔接 子的偶联之前去除单链5'和或3'区域。在一些实施例中，捕获探针中的每一者进一步包 含与一或多个衔接子互补的序列。在一些实施例中，与一或多个衔接子互补的序列邻近祀 捕获序列。在一些实施例中，所述一或多个衔接子经由连接偶联到祀核酸。在一些实施例 中，所述一或多个衔接子含有与PCR引物序列实质上互补的序列。在一些实施例中，所述一 或多个衔接子含有实质上类似于PCR引物序列的序列。 在一些实施例中，所述连接通过DNA或RNA连接酶进行。在一些实施例中，所述 一或多个衔接子包含经特别设计W充当聚合酶链反应引发、逆转录或通过其它DNA修饰或 RNA修饰酶的修饰的位点的序列。 在一些实施例中，扩增所捕获的祀核酸的步骤包含进行聚合酶链反应（PCR)。在 一些实施例中，PCR反应使用选自Taq、Bst和/或化i29的聚合酶。在一些实施例中，所捕 获的祀标在扩增之前逆转录。在一些实施例中，逆转录由具有逆转录酶活性的聚合酶催化。 在一些实施例中，聚合酶是Pyro地age或nH。在一些实施例中，逆转录由一种酶催化，并且 PCR扩增由第二种酶进行。 在一些实施例中，扩增所捕获的祀核酸的步骤等溫进行。在一些实施例中，祀核酸 和/或一或多个衔接子经由连接或酶聚合而环化。 在一些实施例中，PCR用单一引物对进行。在一些实施例中，PCR用一种引物进行。 在一些实施例中，PCR用附接到衬底的引物进行。在一些实施例中，PCR使用通用引物、特异 性引物或聚（A)引物的组合进行。 在一些实施例中，可检测实体选自由W下组成的群组巧光团、染料、生物素、放射 性同位素、抗体、适体、多肤、量子点、发色团或信号产生酶。在一些实施例中，可检测实体提 供于反应混合物中作为标记引物、标记dNTP和/或插入染料。在一些实施例中，可检测实 体与正向引物结合。在一些实施例中，可检测实体与反向引物结合。在一些实施例中，可检 测实体与多种引物结合。 在一些实施例中，所捕获的一或多个祀核酸在扩增之前与捕获探针分离。在一些 实施例中，所捕获的一或多个祀核酸通过使用热量、化学变性剂或解旋酶变性而与捕获探 针分离。 在一些实施例中，在扩增时间期间存在衬底。在一些实施例中，扩增所捕获的一或 多个祀核酸的步骤使用单一引物进行。在一些实施例中，扩增所捕获的一或多个祀核酸的 步骤使用少于5 (例如小于4、3或2)个引物对进行。 在一些实施例中，PCR是偏向的W使得扩增的一或多个祀核酸的实质性部分是单 链的。在一些实施例中，通过设计具有与反向引物相比明显较低的退火溫度的正向引物并 且首先在较低的退火溫度下热循环并且接着在较高的退火溫度下热循环来使PCR偏向于 单链扩增的祀核酸。在一些实施例中，通过W-定浓度添加正向引物W使得其在PCR反应 期间耗尽来使PCR偏向于单链扩增的祀核酸。在一些实施例中，正向引物与反向引物之间 的比率小于1:2、1:3、1:4、1:5或1:10。在一些实施例中，正向引物与反向引物之间的比率 小于1:2。在一些实施例中，通过设计反向引物具有与正向引物相比明显较低的退火溫度并 且首先在较低退火溫度下热循环并且接着在较高退火溫度下热循环来使PCR偏向于单链 扩增的祀核酸。在一些实施例中，通过W-定浓度添加反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测靶核酸的方法，其包含以下步骤：a)使样品与各包含至少一个靶捕获序列的一或多个捕获探针在准许所述一或多个捕获探针捕获所述样品中的一或多个靶核酸的条件下接触；b)在包含可检测实体的反应混合物中扩增所捕获的一或多个靶核酸以使得扩增的一或多个靶核酸标记有所述可检测实体；c)用多个再捕获探针培育扩增产物以使得所述扩增的一或多个靶核酸被所述多个再捕获探针再捕获；d)检测由与再捕获的扩增的一或多个靶核酸结合的可检测实体产生的信号，其中所述可检测信号的存在和/或丰度指示所述样品中的所述一或多个靶核酸的存在和/或丰度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：达尼埃尔·C·普赖格伊邦，伊萨克·斯托纳，安东尼·富斯科，迈克尔·R·塔克特，
申请(专利权)人：萤火虫生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US