用于生物测定的底物介导的反应器制造技术

本发明专利技术除其他情况之外提供了用于高效、稳健且多重分析生物分子的方法、组合物以及系统，其基于与测定试剂的受控释放结合的底物介导的区室化，以用于无干扰检测生物分子。

Substrate mediated reactor for bioassay

The present invention provides among other condition for efficient and robust and multiple analysis of biological molecules, compositions and methods based on the system, and the controlled release of substrate binding reagent mediated by compartmentalization, with no interference for the detection of biological molecules.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求于2014年5月23日提交的美国临时专利申请序列号62/002,664的优先权和权益，所述申请的全部内容以引用的方式并入本文。专利技术背景生物分子的量化是基础科学、转化研究和临床诊断的基础。能够同时分析多种生物标记的方法简化了工作流程并且最小化样品体积的要求。然而，由于靶特异性检测试剂的非预期性相互作用，往往难以以多重方式量化生物标记。这些“脱靶”相互作用限制了跨蛋白质和核酸靶的生物分子测量的多重水平、灵敏度以及特异性。鉴于抗体固有的混杂性，蛋白质的多重检测为一项极具挑战性的任务。通常用于免疫测定的一种方法为夹心测定。在此测定中，使用底物结合的“捕获抗体”捕获靶并且通过使用结合靶并携带可检测部分的“检测抗体”使得靶的结合显而易见。因为抗体总是表现出与脱靶样品分子或脱靶检测抗体的一定水平的交叉反应性，所以当以多重格式进行免疫测定时，测定的性能往往受到损害。因此，夹心测定最常以酶联免疫吸附测定(ELISA)格式使用，其中单一蛋白质靶以每个测定孔检测。使用在单重ELISA中表现良好的抗体对进行的多重蛋白测定的发展仍然需要大量的验证努力来确保相容性。相似的相容性挑战存在于核酸的多重检测中。此挑战的一个实例为在多重PCR中。虽然PCR提供一种扩增靶分子以用于高灵敏度检测的稳健手段，但是当在一次扩增多种核酸靶时，所述技术容易出现非特异性扩增。通常，每种靶的扩增均使用具有对该靶特异的正向引物和反向引物的引物组来进行。当在单孔中扩增多种靶时，使用多个引物组。与免疫测定中的抗体交叉反应性相似，引物也可与彼此(异源二聚体)、与脱靶链、或与自身(同源二聚体)相互作用，从而导致脱靶物质的非预期扩增。因为这个原因，大多数PCR反应物，尤其是在定量PCR的情况下，在各个反应孔中物理分离。专利技术概述本专利技术提供一种用于靶特异性检测生物分子的高效、稳健且多重的测定系统。具体地，本专利技术基于与测定试剂的受控释放相结合的底物介导的区室化，以用于使用简单的器械，诸如流式细胞仪或微阵列扫描仪来无干扰检测生物分子。因此，本专利技术克服了与试剂不相容性和“脱靶”相互作用相关联的各种挑战，并且实现了跨蛋白质和核酸靶的生物分子测量的显著提高的多重水平、灵敏度和特异性。因此，在一个方面，本专利技术提供用于分析生物分子的方法，其包括：在允许靶生物分子与捕获部分之间的结合的条件下，将样品与多个多功能底物孵育，其中每个多功能底物包含具有一个或多个捕获部分的靶捕获区域以及通过可释放手段具有一种或多种检测试剂的试剂储存区域，每个所述捕获部分特异性结合靶生物分子；将不混溶流体与在载体流体中的所述多个多功能底物接触，从而形成多个隔室，每个隔室包含单个多功能底物；从所述试剂储存区域释放所述一种或多种检测试剂，以使得所述检测试剂在单个隔室内与结合捕获部分的所述靶生物分子结合；以及分析在所述检测部分与结合所述捕获部分的所述生物分子之间的结合，从而分析在所述样品中的所述靶生物分子的存在或量。在一些实施方案中，所述多功能底物为多功能微粒。在一些实施方案中，所述底物由水凝胶制成。在一些实施方案中，所述水凝胶选自光致抗蚀剂、二氧化硅、聚苯乙烯、聚乙二醇、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、琼脂糖、脱乙酰壳多糖、藻酸酯、PLGA或其任何组合。在一些实施方案中，所述微粒为非球形颗粒。在一些实施方案中，每个隔室的形状基本上由所述多功能底物的形状限定。在一些实施方案中，所述多个多功能底物包括单分散性微粒。在一些实施方案中，所述多个多功能底物包括其最长尺寸在1μm与500μm之间的多分散性微粒。在一些实施方案中，所述多功能底物包含空腔、凹陷或孔。在一些实施方案中，所述多功能底物包含一个或多个细胞或细菌。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞或细菌释放能够在单个隔室内通过载体流体扩散的分子。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞或细菌释放能够通过不可渗透或半渗透不混溶相扩散的分子。在一些实施方案中，由所述一个或多个细胞或细菌释放的分子具有治疗活性或益生菌活性。在一些实施方案中，所述一个或多个捕获部分选自抗体、纳米抗体、寡核苷酸探针、肽核酸、小分子、适体、细胞、细菌、病毒、细胞器、肽、或其组合。在一些实施方案中，所述一种或多种检测试剂选自检测抗体、纳米抗体、酶、PCR引物、蛋白质、寡核苷酸、肽、适体、小分子、其他化学化合物或其组合。在一些实施方案中，所述一种或多种检测试剂用检测部分标记，所述检测部分选自荧光团、发色团、放射性同位素、生物素、酶产物、抗体、量子点、分子信标和/或适体。在一些实施方案中，所述多功能底物包含一个或多个疏水性区域。在一些实施方案中，所述一个或多个疏水性区域由疏水性聚合物构成。在一些实施方案中，所述不混溶流体为可选择性渗透的。在一些实施方案中，所述不混溶流体为油并且所述载体流体为含水流体。在一些实施方案中，所述不混溶流体为含水流体并且所述载体流体为油。在一些实施方案中，所述油选自FluorinertFC-40油、Tegasoft或矿物油。在一些实施方案中，所述油还包含表面活性剂诸如ABILWE-09、PFPE-PEG或一些其他双功能分子。在一些实施方案中，所述靶生物分子为蛋白质、核酸、细胞、细菌或化学化合物。在一些实施方案中，所述可释放手段选自可逆性相互作用、不可逆反应、可逆性交联剂或光可裂解接头。在一些实施方案中，所述可逆性相互作用选自静电相互作用、物理相互作用、磁性相互作用、化学相互作用或核酸双链体形成。在一些实施方案中，所述不可逆反应为键裂解。在一些实施方案中，所述可逆性交联剂选自分别通过羟胺、硫醇和/或高碘酸盐可裂解的EGS、DSP和/或DST。在一些实施方案中，所述光可裂解接头为基于1-(2-硝基苯基)乙基的接头。在一些实施方案中，所述一种或多种检测试剂以受控方式从所述试剂储存区域释放到所述隔室中。在一些实施方案中，所述受控方式包括使用加热、紫外光、可见光、微波辐射、酶催化、pH或特异性化学剂作为刺激。在一些实施方案中，所述一种或多种检测试剂在不同时间释放。在一些实施方案中，所述接触步骤包括乳化的步骤。在一些实施方案中，所述乳化的步骤通过机械搅拌或剪切、声音搅动或微流体装置来实现。在一些实施方案中，所述分析步骤包括量化存在于所述靶捕获区域中的检测部分的量，从而确定样品中的靶生物分子的量。在一些实施方案中，所述每个多功能底物还包含编码区域。在一些实施方案中，所述多功能底物使用基于荧光识别器或可见光识别器的流式细胞仪或微阵列扫描仪来分析。在一些实施方案中，所述隔室在检测之前反转。在一些实施方案中，所述多个多功能底物包含具有针对多个靶生物分子的多个捕获部分的多个多功能底物子组，并且其中所述方法分析在所述样品中所述多个靶生物分子的存在或量。在另一个方面，本专利技术提供用于产生限定底物的隔室的方法，其包括：将不混溶流体与分散在载体流体中的底物集合接触以形成混合物；以及向所述混合物添加能量，从而在不混溶流体内产生离散的、含有底物的载体流体隔室，其中所述隔室的尺寸大于在底物不存在下所形成的隔室的尺寸。在一些实施方案中，所述底物为颗粒。在一些实施方案中，所述底物由水凝胶制成。在一些实施方案中，所述颗粒是非球形。在一些实施方案中，所述隔室的形状基本上由其中所含有的颗粒的形状限本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分析生物分子的方法，其包括：a)将样品与多个多功能底物孵育，其中每个多功能底物包含具有一个或多个捕获部分的靶捕获区域，每个所述捕获部分特异性地结合靶生物分子，以及通过可释放手段具有一种或多种检测试剂的试剂储存区域，这是在允许所述靶生物分子与所述捕获部分之间的结合的条件下；b)将不混溶流体与在载体流体内的所述多个多功能底物接触，从而形成多个隔室，每个所述隔室包含单个多功能底物；c)将所述一种或多种检测试剂从所述试剂储存区域释放，以使得所述检测试剂在单个隔室内与结合所述捕获部分的所述靶生物分子结合；以及d)分析在所述检测试剂与结合所述捕获部分的所述生物分子之间的所述结合，从而分析在所述样品中所述靶生物分子的存在或量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.23 US 62/002,6641.一种用于分析生物分子的方法，其包括：a)将样品与多个多功能底物孵育，其中每个多功能底物包含具有一个或多个捕获部分的靶捕获区域，每个所述捕获部分特异性地结合靶生物分子，以及通过可释放手段具有一种或多种检测试剂的试剂储存区域，这是在允许所述靶生物分子与所述捕获部分之间的结合的条件下；b)将不混溶流体与在载体流体内的所述多个多功能底物接触，从而形成多个隔室，每个所述隔室包含单个多功能底物；c)将所述一种或多种检测试剂从所述试剂储存区域释放，以使得所述检测试剂在单个隔室内与结合所述捕获部分的所述靶生物分子结合；以及d)分析在所述检测试剂与结合所述捕获部分的所述生物分子之间的所述结合，从而分析在所述样品中所述靶生物分子的存在或量。2.如权利要求1所述的方法，其中所述多功能底物为多功能微粒。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述底物由水凝胶制成。4.如权利要求3所述的方法，其中所述水凝胶选自光致抗蚀剂、二氧化硅、聚苯乙烯、聚乙二醇、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、琼脂糖、脱乙酰壳多糖、藻酸盐、PLGA或其任何组合。5.如任何权利要求2所述的方法，其中所述微粒为非球形颗粒。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个隔室的形状基本上由所述多功能底物的形状限定。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个多功能底物包括单分散性微粒。8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述多个多功能底物包括其最长尺寸在1μm与500μm之间的多分散性微粒。9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多功能底物包含空腔、凹陷或孔。10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多功能底物包含一个或多个细胞或细菌。11.如权利要求10所述的方法，其中所述一个或多个细胞或细菌释放能够在单个隔室内通过所述载体流体扩散的分子。12.如权利要求10所述的方法，其中所述一个或多个细胞或细菌释放能够通过不可渗透或半渗透不可混溶相扩散的分子。13.如权利要求11或12所述的方法，其中由所述一个或多个细胞或细菌释放的分子具有治疗活性或益生菌活性。14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个捕获部分选自抗体、纳米抗体、寡核苷酸探针、肽核酸、小分子、适体、细胞、细菌、病毒、细胞器、肽、或其组合。15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种检测试剂选自检测抗体、纳米抗体、酶、PCR引物、蛋白质、寡核苷酸、肽、适体、小分子、其他化学化合物或其组合。16.如权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种检测试剂用选自以下的检测部分标记：荧光团、生色团、放射性同位素、生物素、酶产物、抗体、量子点、分子信标和/或适体。17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多功能底物包含一个或多个疏水性区域。18.如权利要求17所述的方法，其中所述一个或多个疏水性区域由疏水性聚合物构成。19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不混溶流体为可选择性渗透的。20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不混溶流体为油并且所述载体流体为含水流体。21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不混溶流体为含水流体并且所述载体流体为油。22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述油选自FluorinertFC-40油、Tegasoft或矿物油。23.如权利要求22所述的方法，其中所述油还包含表面活性剂诸如ABILWE-09、PFPE-PEG或一些其他双功能分子。24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶生物分子为蛋白质、核酸、细胞、细菌或化学化合物。25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可释放手段选自可逆性相互作用、不可逆反应、可逆性交联剂或光可裂解接头。26.如权利要求25所述的方法，其中所述可逆性相互作用选自静电相互作用、物理相互作用、磁性相互作用、化学相互作用或核酸双链体形成。27.如权利要求25所述的方法，其中所述不可逆反应为键裂解。28.如权利要求25所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：I·斯托纳，T·埃普斯，D·普赖格伊邦，J·D·泰特尔，A·温德沐斯，G·多兰，
申请(专利权)人：萤火虫生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US