本发明专利技术提供一种核酸分析用流动池，其是用于借助能够光化学切断的核苷酸的测序反应的核酸分析用流动池，可在提高光切断反应的反应效率的同时减少荧光检测时的干扰，从而可提高确定序列的正确性，缩短操作时间，使结合碱基长度变长。本发明专利技术的核酸分析用流动池贴合有具备滤光片(102)的第一基板(101)、具有用于形成流路的中空部中空板(103)和透过第一光的第二基板(105)，所述滤光片(102)反射使流路内物质的化学结构发生变化的第一光。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及核酸分析用流动池(flow cell)和核酸分析装置。
技术介绍
确定DNA、RNA的碱基序列的新技术正逐步实用化。在利用一直以来使用的电泳的方法中，预先调制由用于确定序列的DNA片段或RNA试样进行逆转录反应而合成的cDNA片段试样，利用众所周知的桑格(Sanger)法实施双脱氧(dideoxy)反应后进行电泳，通过计测分子量分离展开图案进行解析。对此，近年来，提出了通过将大量作为试样的DNA片段固定于基板而并行确定大量片段的序列信息的方法。在非专利文献I中，使用微粒作为担载DNA片段的载体，在微粒上进行PCR。之后，向设置有大量的使孔径与微粒的尺寸配合的孔的板放入担载有PCR扩增的DNA片段的微粒，以焦磷酸测序方式进行读取。此外，在非专利文献2中，使用微粒作为担载DNA片段的载体，在微粒上进行PCLi后，将微粒散布在玻璃基板上进行固定，在玻璃基板上进行酶反应(连接(Iigat1n))，与带有荧光色素的引物结合而进行荧光检测，得到各片段的序列信息。进一步，在非专利文献3中，将具有同一序列的许多DNA探针预先固定在基板上。此夕卜，将DNA试样切断后，使DNA探针序列和互补链的接头(adaper)序列附加于各DNA试样片段的端点。使它们在基板上杂交，从而使每一分子试样DNA片段随机固定在基板上。在该情况下，基板上不发生DNA延伸反应，结合带有荧光色素的基质后，进行未反应基质的洗涤、荧光检测，得到试样DNA的序列信息。如上所述，开发了通过在基板上固定大量核酸片段试样而并行确定大量片段的序列信息的方法，从而逐步实用化。专利文献I中公开了并行确定大量序列信息的详细内容。测序反应在内部具有流路的流动池中进行。流路表面涂覆有丙烯酰胺，在丙烯酰胺上接枝有正向引物和反向引物。将包含作为测定对象的多种模板的溶液导入流动池内后，对流动池施以温度循环而在基板上进行扩增反应，从而在基板上形成与模板具有相同序列的多个菌落。一个菌落是扩增的多个复制模板的集合体，复制模板与测定对象模板具有相同的序列或互补的序列。扩增后，使测序引物与菌落内的模板杂交来进行测序反应。在测序反应中，使用W02004/018493所公开的核苷酸。核苷酸具有经由能够被切断的连接物(I inker)连接的的荧光分子和位于糖的第3位氧的离去基团。在测序反应中，使用来源于4种碱基A、T、C、G的4种核苷酸。4种核苷酸被各自不同的荧光色素标记。向流动池内注入包含聚合酶和4种核苷酸的溶液，使核苷酸与测序引物结合。之后，对结合有荧光的测序引物进行荧光检测。此时，由于以形成与模板序列互补的序列的方式结合核苷酸，因此通过检测结合后的核苷酸的焚光，可确定作为测定对象的模板的碱基序列。荧光检测后，化学切断分子内连接物而去除荧光分子。通过反复进行核苷酸结合、荧光检测、荧光分子去除的循环而确定模板的碱基序列。现有技术文献专利文献专利文献1:美国专利申请公开第US2012/208194号说明书专利文献2:国际专利W02004/018493专利文献3:美国专利第US7897737B1号说明书专利文献4:美国专利第US8039817B1号说明书专利文献5:美国专利申请公开第US2009/208194号说明书非专利文献非专利文献1: Nature 2005，vol.437，pp.376-380非专利文献2:Science 2005，vol.309，pp.1728-1732非专利文献3:Science 2008，vol.320，pp.106-109
技术实现思路
专利技术所要解决的课题关于专利文献1、专利文献2中记载的方法，由于以一定比例结合有与模板的碱基序列无关的错误的核苷酸，因此存在确定序列的正确性低的课题。此外，随着模板的碱基长度变长，一个菌落中结合错误的核苷酸的模板的比例变高，从而正确的荧光信号减少。作为结果，存在无法使结合碱基长度变长的课题。一般而言，在序列确定过程中，确定短且零散的模板的碱基序列后，在电脑上比对零散的序列，如果结合碱基长度短，则还产生比对的精度降低或比对时间变长的课题。此外，一般而言，由于化学切断中反应时间长，因此也存在每I次操作(run)所需的操作时间长的课题。专利文献3中公开了能够提高核苷酸结合的正确性、缩短切断反应时间的核苷酸。通过消除核苷酸内的糖的第3位氧的离去基团来提高聚合酶与核苷酸的亲和性，从而提高结合时的正确性。此外，通过导入能够以光化学切断的分子内连接物而缩短切断时间。另一方面，专利文献3的核苷酸存在流动池内的光化学切断反应的反应效率本身就低，结合碱基长度不够长的课题。由于测序反应中进行多个循环的反应，因此一点点的反应效率的差异就会对增加循环数的结合时的荧光信号产生大的影响。例如，当I个循环的反应效率为99%时，250个循环后的荧光强度在将I个循环时的荧光强度设为100%时变为0.9925° X 100 =8.1(%)。另一方面，当为98%时，变为0.9825(^100 = 0.6(%)，仅仅1%的反应效率的差异形成8.1-0.6 = 7.5(%)的荧光强度的差异。作为提高光化学切断反应的反应效率的方法，还有使光强度变强的方法，但如果使光强度过强，则会产生如下课题:发生由溶解氧等引起的自由基，并且发生由自由基导致的模板的二聚化反应等副反应，从而使与引物结合的核苷酸的量减少。在如专利文献4所示的那样对流路的上下两面进行检测的情况下，一般而言，离光化学反应的光源近的面的光强度比远的面的光强度强，为了使远的面的光强度变强，如果使光源的光强度变强，则近的面的光强度强于所需以上，从而发生上述的副反应。本专利技术提供用于借助能够光化学切断的核苷酸的测序反应的核酸分析用流动池，其为提高切断反应的反应效率的流动池。用于解决课题的方法本专利技术的核酸分析用流动池贴合有具备滤光片的第一基板、具有用于形成流路的中空部的中空板(中抜含一卜)和透过第一光的第二基板，所述滤光片反射使流路内物质的化学结构发生变化的第一光。专利技术效果根据本专利技术，用于借助能够光化学切断的核苷酸的测序反应的核酸分析用流动池能够提高光切断反应的反应效率并且减少荧光检测时的干扰。由此，能够提高确定序列的正确性，缩短操作时间，使结合碱基长度变长。【附图说明】图1是用于说明本专利技术的核酸分析用流动池构成的一例的图。图2是用于说明本专利技术的核酸分析用流动池构成的一例的图。图3是用于说明本专利技术的核酸分析用流动池构成的一例的图。图4是用于说明本专利技术的核酸分析用流动池构成的一例的图。图5是用于说明本专利技术的核酸分析用流动池构成的一例的图。图6是用于说明本专利技术的核酸分析用流动池构成的一例的图。图7是用于说明本专利技术的核酸分析用流动池构成的一例的图。图8是用于说明本专利技术的核酸分析用流动池制造方法的一例的图。图9是用于说明本专利技术的核酸分析装置的一例的图。图10是用于说明本专利技术的核酸分析装置的一例的图。图11是用于说明本专利技术的核酸分析用流动池构成的一例的图。图12是用于说明本专利技术的核酸分析用流动池构成的一例的图。【具体实施方式】本专利技术的专利技术人进行了深入研究，结果完成了能够实现核苷酸结合正确性高、切断时间短、切断效率也高的测序反应的核酸分析用流动池。本专利技术是一种核酸分析用流动池，其贴合有具备滤光片的第一基板、具本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核酸分析用流动池，其贴合有具备滤光片的第一基板、具有用于形成流路的中空部的中空板和透过第一光的第二基板，所述滤光片反射使流路内物质的化学结构发生变化的第一光。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：奈良原正俊，庄司智广，
申请(专利权)人：株式会社日立高新技术，
类型：发明
国别省市：日本;JP
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