一组特异识别大田软海绵酸的核酸适配体制造技术

本发明专利技术提供了一组特异性识别大田软海绵酸的单链DNA核酸适配体，属于食品安全生物技术领域。本发明专利技术利用氧化石墨烯辅助分离的指数富集配体系统进化技术，经过13轮反复的孵育、分离、扩增、制备单链的体外筛选，获得了一组核酸适配体，经亲和性和特异性分析，从中选出了一条对大田软海绵酸具有高亲和性和高特异性的适配体OA-27。对去除引物区的OA27-1进行分析，发现OA27-1也具有高亲和性和特异性。该组适配体在水产品中大田软海绵酸的分析检测和临床上大田软海绵酸中毒的诊断和治疗方面具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一组特异识别大田软海绵酸的核酸适配体
本专利技术属于食品安全生物
，涉及对腹泻性贝类毒素大田软海绵酸具有高亲和性和高特异性的识别元件——单链DNA核酸适配体的序列。
技术介绍
大田软海绵酸(Okadaicacid，OA)是一种小分子脂溶性毒素，是由鳍藻属和原甲藻属藻类产生的一种次生代谢产物。贻贝、扇贝、牡蛎等贝类生物滤食这些有毒藻类后使大田软海绵酸在其体内积累。当人误食了这些贝类后，就可能引起中毒，症状为腹泻、恶心、呕吐、腹痛等。由于其主要中毒症状为腹泻，所以将其称为腹泻性贝类毒素(DiarrheticShellfishPoisoning，DSP)。腹泻性贝类毒素还有鳍藻毒素(Dinophysistoxin，DTX)、蛤毒素(Pectenotoxin，PTX)、扇贝毒素(Yessotoxin，YTX)等。OA虽然是一种非致命毒素，没有很强烈的毒性，但分布广泛，热稳定性好，在平常的烹饪过程中不能通过高温加热破坏其化学结构和降低其毒性，因此中毒事件时有发生。OA引起中毒的机制是，OA可特异性抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A的活性，导致大量蛋白质的过磷酸化和积累，改变信号传导途径，破坏细胞生物机能，导致细胞凋亡。另外，研究发现OA还是肿瘤促进因子。目前，检测大田软海绵酸的方法主要有：小鼠生物分析法(MBA)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、表面等离子共振法(SPR)、蛋白磷酸酶抑制分析法(PPIA)等。MBA根据注射毒素后小鼠的存活时间和中毒症状来评价毒性，结果较为直观，是很多国家检测贝类毒素的标准方法；但该方法受小鼠品系和个体差异的影响较大，重复性差，小鼠购买和饲养费用也较高，且无法确定毒素的具体成分和含量。HPLC和SPR灵敏度高、检出限低，并可实现连续自动检测；但样品前处理要求高，需要昂贵的仪器设备和专业的技术人员，不适合现场快速检测。ELISA等依赖抗原-抗体结合反应的检测方法操作简便，特异性强，灵敏度高，无需昂贵的仪器设备，适用于现场快速检测；然而，制备抗体的过程繁琐耗时，成本昂贵，且OA的相对分子量仅为804.5，无免疫原性，需要偶联大分子载体后才可用于制备抗体，另外，不同批次抗体的重复性和稳定性不如核酸适配体，储存条件也较为严苛。PPIA检测受OA特异性抑制的蛋白磷酸酶的活性，所以特异性较好，检测时间较短，但会受到样品和环境的干扰。核酸适配体(Aptamer)是近年来新兴的一种靶标识别分子，它是一条长度为40-100nt的单链寡核苷酸，可形成发卡、假结、凸环、G-四联体等空间构象，通过空间结构的匹配、氢键作用、静电作用等与靶标稳定结合。适配体与靶标结合的亲和性和特异性可与抗体相媲美，同时与抗体相比还具有很多优势：(1)筛选得到的适配体序列可由生物公司合成，既不依赖动物体内免疫，也可减少不同生产批次间的差异；(2)适配体的靶标种类极其广泛，小到氨基酸、核苷酸、金属离子、毒素、有机染料、抗生素、辅因子等小分子物质，大到酶、生长因子、抗体、核酸等生物大分子，甚至完整的病毒、细菌和细胞等都可作为适配体筛选的靶标；(3)筛选适配体的配体指数富集系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)是一种体外筛选技术，不涉及任何动物和细胞，毒素和没有免疫原性的小分子也可筛选到高亲和力的适配体；(4)核酸适配体稳定性好，可长期保存并可常温运输，也更易于标记或化学修饰。目前，对于小分子物质的适配体主要是通过把靶标固定在酶标板、磁珠或亲和层析柱上进行SELEX筛选。这种固定法可能由于空间排阻效应使小分子丧失部分适配体识别的位点，有些小分子还需要连接合适的基团或分子进行固定，改变了天然构象，可能影响筛选到的适配体的应用。毛细管电泳的应用使SELEX筛选非固定小分子的适配体成为可能，然而这需要昂贵的毛细管电泳设备和娴熟的操作技术和经验。本专利技术以水产品中常见的腹泻性贝类毒素OA为靶标，利用氧化石墨烯(GrapheneOxide，GO)辅助分离的非固定SELEX技术(GO-SELEX)筛选得到了对OA具有高亲和性和特异性的单链DNA核酸适配体。该适配体可用于快速、灵敏、特异地检测水产品中的OA，也可为临床上OA中毒的诊断和治疗提供新的途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能特异性识别大田软海绵酸、且具有高亲和性的核酸适配体序列，以克服现有的检测大田软海绵酸技术的不足，特别是免疫检测法中，抗体制备必须依赖动物或细胞，过程繁琐耗时，成本昂贵，不同批次抗体间的重复性和稳定性欠佳，储存条件也较为严苛等缺陷，为开发新型的大田软海绵酸分析检测方法奠定基础。为实现上述目的，本专利技术采用氧化石墨烯辅助分离的SELEX技术，利用氧化石墨烯通过π-π作用非特异性吸附单链DNA(singlestrandDNA，ssDNA)的特性，在SELEX的分离步骤中，用氧化石墨烯吸附未与大田软海绵酸结合的游离ssDNA，使其与大田软海绵酸-ssDNA复合物分离，通过多轮筛选的系统进化，获得特异性高、亲和力强的大田软海绵酸核酸适配体，其序列为：OA-27：5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTATTTAGCCATGCTGAGGGAGATGCGCAGTCACTACCACCTGACTCGAAGTCGTGCATCTG-3’OA27-1：5’-ATTTAGCCATGCTGAGGGAGATGCGCAGTCACTACCACCT-3’本专利技术的优点是：1)与抗体相比，适配体可人工合成，不依赖动物和细胞，周期短、成本低、批次间的差异小，便于化学修饰，稳定性也好，可长期保存。2)筛选小分子物质的核酸适配体，传统的方法是将小分子靶标固定在磁珠、酶标板、亲和层析柱等固相表面，固相表面的空间排阻效应可能使靶标丧失部分适配体的识别位点，有些小分子物质需要通过连接分子偶联到固相表面，这就改变了其天然构象，这些都可能影响适配体在实际检测中对小分子的识别效果。本专利技术采用氧化石墨烯辅助分离的SELEX技术，无需固定小分子毒素，可筛选到针对天然状态毒素分子的适配体。附图说明图1是不同用量氧化石墨烯吸附ssDNA的试验结果图2是筛选大田软海绵酸核酸适配体的SELEX技术的流程图图3是适配体序列的二级结构图，A为OA-27，B为OA27-1图4是适配体的饱和结合曲线图，A为OA-27，B为OA27-1图5是适配体的特异性试验结果，A为OA-27，B为OA27-1表1SELEX筛序过程中每一轮的筛选条件表2挑选出的8条ssDNA序列的解离常数Kd值具体实施方式1、随机ssDNA文库和引物的合成构建了长度为80nt的随机ssDNA文库，由两端各20nt的引物区和中间40nt的随机区组成，序列为：5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCT-N40-GACTCGAAGTCGTGCATCTG-3’(N40代表40个随机核苷酸)，由美国IntegratedDNATechnologies公司合成。上游引物：5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCT-3’下游引物：5’-CAGATGCACGACTTCGAGTC-3’5’磷酸化的下游引物：5’-P-CAGATGCACGACTTCGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异识别大田软海绵酸的单链DNA核酸适配体，具有序列表1、2所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.特异性识别大田软海绵酸的单链DNA核酸适配体，该适配体的序列如序列表中序列1或2所示。2.根据权利要求1所述的适配体，其特征在于，所述序列为人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。3.特异性识别大田软海绵酸的核酸适配体，该适配体为在权利要求1所述适配体序列的5’端或3’端连接或标记其他功能基团或分子，并与权利要求1所述适配体具有相同功能的适配体，所述其他功能基团或分子选自：生物素、氨基、巯基...

【专利技术属性】
技术研发人员：王周平，顾华杰，段诺，吴世嘉，陈秀娟，郝丽玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32